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玉米(Z Mays)是世界主要粮食作物之一,其淀粉含量约占籽粒比重的70%左右,淀粉的理化性质会直接影响玉米的产量和品质。淀粉以光合作用产物蔗糖为原料,由多种关键酶共同参与合成,主要酶包括:腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase)、淀粉合成酶(starch synthases,SS)、淀粉分支酶(starch branching enzymes,SBE)、淀粉去分支酶(starch-debranching enzymes,DBE)和淀粉磷酸化酶(starch phosphorylase,PHO)。目前,玉米籽粒中淀粉生物合成关键酶的功能已较为清楚,但对玉米淀粉合成关键酶基因上游存在的转录调控机制的研究却较少。在其他作物中的研究表明,淀粉生物合成过程中存在转录调控,转录调控通过调节淀粉生物合成关键酶基因的表达水平,调控淀粉的生物合成。因此,研究玉米淀粉生物合成过程中的分子调控机制具有重要意义。本研究通过共相关表达分析发现转录因子ZmGRAS20和ZmEREB26与玉米胚乳中高表达的淀粉合成关键酶基因存在基因的共表达现象;采用半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR分析目的基因表达模式;应用亚细胞定位与酵母激活研究转录因子ZmGRAS20、ZmEREB26的自身特性;采用玉米胚乳瞬时过表达与酵母单杂交进一步分析转录因子ZmGRAS20、ZmEREB26与玉米淀粉合成关键酶基因启动子间的相互作用模式;通过基因转化技术,为进一步在玉米本体中研究目的基因的功能奠定基础。具体研究结果如下:1.以玉米自交系18-599授粉后15 d左右的胚乳cDNA为模板,参考玉米自交系B73基因组序列,克隆得到ZmGRAS20、ZmEREB26基因,并对克隆序列的蛋白序列进行分析。结果表明:ZmGRAS20基因的cds序列为1527 bp,编码508个氨基酸,是一个GRAS家族的转录因子;ZmEREB26基因的cds序列为1287 bp,编码428个氨基酸,是一个AP2/EREBP家族的转录因子。2.半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR分析目的基因的时空表达特性。结果表明:ZmGRAS20和ZmEREB26基因均在玉米胚乳中高表达,且ZmGRAS20基因在种子授粉后10 d才开始有表达,18 d表达量最高;ZmEREB26基因在授粉后4-8 d的种子中表达量较低,10 d表达量最高,10 d以后基因的表达量降低。基因枪轰击洋葱表皮细胞分析ZmGRAS20、ZmEREB26基因编码蛋白的亚细胞定位,结果表明转录因子ZmGRAS20和ZmEREB26均定位于洋葱表皮细胞的核中,它们在细胞核内对玉米基因的转录起到调控作用。酵母激活分析结果表明,转录因子ZmEREB26具有转录激活活性,包含转录激活结构域;ZmGRAS20在酵母菌株中不具有转录激活活性,不能激活报告基因的表达。3.玉米胚乳瞬时过表达和酵母单杂交实验用于研究转录因子ZmGRAS20和ZmEREB26与玉米淀粉合成关键酶基因启动子之间的作用模式。结果表明:转录因子ZmGRAS20能在酵母中直接与GBSSI基因的启动子结合并在玉米胚乳中瞬时过表达抑制其活性;能极显著促进SSⅢa基因启动子活性,但在酵母中没有直接结合作用。转录因子ZmEREB26能在酵母中直接与ISA1、ISA2基因的启动子结合并在玉米胚乳中瞬时过表达促进ISA1、ISA2基因启动子的活性;能促进Bt2、GBSSI、SSI、SSⅢa基因启动子的活性,但在酵母中没有直接结合作用。4.构建ZmEREB26基因的转基因载体,以玉米自交系18-599幼胚作为外植体,采用农杆菌侵染转化方法,经过继代、筛选、分化等步骤成功获得转基因幼苗。进一步通过GUS染色、PCR检测等方法,证明ZmEREB26基因已成功转化入玉米植株中。