论文部分内容阅读
鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis, IB),是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitisvirus, IBV)引起的一种急性、高度感染性的病毒性疾病。IBV是套式病毒目冠状病毒科(Coro?avz>z_t/ae)冠状病毒亚科(Coro?avz>z_?ae)的y冠状病毒（gammacoronavims)。为了探索IBV强毒致弱的分子机理，为该病新疫苗的设计以及病毒致病机理研究提供理论依据，本研究以ck/CH/LDL/97I为模式病毒，进行了亲本强毒和鸡胚传代致弱毒之间基因组差异，体内外增殖动态，抗体水平及感染后机体内细胞因子的变化等方面研究。ck/CH/LDL/97I P5和P115基因组分别由27680和27682个核苷酸组成。基因组结构为：5’-UTR-基因1(ORFla, lb)-S-基因3(ORFs3a,3b, E)-M-基因5(ORFs5a,5b)-N-UTR-3’?系统发育分析显示ck/CH/LDL/97I与美国IBV分离株亲缘关系较近，表明ck/CH/LDL/97I与美国IBV毒株起源相同或具有流行病学联系。本研究对IBV强毒株ck/CH/LDL/97I P5(P5)及其传代致弱毒株ck/CH/LDL/97IP115(P115)全基因组序列进行测序和比对，ck/CH/LDL/97I经115次传代后，nsp5、nsp6、nsp7、nsp8、nsplO,0RF3b和0RF5a基因未发生突变。由于特异性病毒亚群的扩增，nsp4、nsp9、nspll/12、nspl4、nspl5、nspl6和0RF3a基因虽然发生了突变，但是未导致编码氨基酸的改变。与P5相比，P115的5’-和3’-UTRs分别有1处和3处核苷酸突变，M基因和基因5之间有2个核苷酸的插入，P115的S基因存在大量突变，并且一些核苷酸突变导致了氨基酸置换。S2基因比S1基因存在更多的突变，在0RF1编码的nsps基因中，nsp3基因发生的突变最多0本研究利用突光定量RT-PCR检测P5和P115接种鸡胚后12、24和36h的鸡胚尿囊液中的病毒载量，结果显示P5和P115在鸡胚中的增殖特征相似，病毒载量在接种后24h达到顶峰。为了进一步评价P5和P115的复制能力，本研究利用突光定量PCR检测了P5和P115接种SPF鸡后9个组织中的病毒载量，结果显示:P5和P115接种后4?21天，大部分组织能检测到病毒RNA。但仍有部分组织未检测到病毒RNA，接种后7?21天，P5接种鸡组织中病毒载量高于P115接种鸡，P115接种后4天的气管，肺和哈德氏腺中病毒载量高于P5接种鸡。病毒分离结果显示：P5和P115接种后4和7天的大部分组织能分离到病毒，P5接种组的病毒分离率高于P115接种组。病毒分离和突光定量PCR结果表明P115在一些组织中的复制能力比P5弱。ELISA结果显示，P115接种鸡血清中IBV抗体滴度（0D值）低于P5接种鸡，说明连续鸡胚传代使P115的抗原性减弱。再分离病毒的S1基因序列分析表明P5和P115接种鸡的不同组织中存在病毒亚群。为了进一步研究IBV强弱毒与宿主免疫应答的关系，本研究利用突光定量PCR检测了哈德氏腺，胸腺，盲肠扁桃体，法氏囊，脾中15种细胞因子及调节因子的表达量。结果显示：P5和P115接种鸡不同组织中细胞因子的表达情况各异，P5和P115都能引起脾脏中IFN-a上调表达，表明IFN-a在机体对IBV产生先天性免疫应答的过程中十分重要。P5接种鸡和P115接种鸡脾脏中cMGF的表达量均显著上调表达，并且P5接种鸡cMGF的表达程度高于P115接种鸡，表明cMGF的上调表达可能是由病毒复制引起的。