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目的：
1、探索一种快速、便捷且经济的新方法，能在体外大量制备小鼠优势不成熟CD8 α<'+>DC2细胞。
2、观察所制备的优势不成熟CD8 α<'+>DC2在体外抑制同种异基因混合淋巴细胞反应(MLR)和激活同系T细胞的能力。
3、建立小鼠GVHD和红白血病动物模型，在动物模型上观察优势DC2细胞体内预防GVHD的作用，以及是否能够在防治GVHD的同时不增加白血病复发的危险。
方法：
实验中所用小鼠均为SPF级小鼠，饲养环境和条件均符合SPF级标准。取C57BL/6(H-2<'b>)小鼠的股、胫骨骨髓细胞，裂解红细胞后计数，以4.00×10<'6>/ml的浓度种于含10﹪胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基中，37℃、5﹪CO2培养，同时加入5 ng/ml GM-CSE，20 ng/ml IL-4，100 ng/ml SCF和25 ng/ml Flt3L诱导DC，对照组设加100 ng/ml SCF+25 ng/ml Flt3L+0.4ng/ml GM-CSF组，以及不加细胞因子组。取第3、7、16、22天的细胞计数绘制总细胞曲线，相差显微镜观察活细胞形态变化，取第3天的细胞进行CD11c免疫荧光染色及透射电镜观察细胞形态；并取第3、7、16天细胞进行四色荧光流式细胞术检测所诱导的细胞中Lin<'->CD11c<'+>细胞的CD8 α、MHC Ⅱ、CD80、CD40、CD11b的表达情况。用相同的制备、培养和检测方法检测同一小鼠脾细胞优势不成熟CD8 α<'+>DC细胞的数量、形态学和表面分子的表达情况作为比对。取诱导第3天的C57BL/6(H-2<'b>)的优势不成熟CD8 α<'+>DC体外与经丝裂霉素C处理的同系脾细胞共培养，MTT法观察其激活同系T细胞的能力。建立以2×10<'6>BALB/c(H-2<'d>)脾细胞为刺激细胞，2×10<'5>C57BL/6(H-2<'b>)脾细胞为反应细胞的同种异基因MLR体系，观察不同数目的(4×10<'4>到8×10<'6>，DC/反应细胞的浓度比为0.2：1，0.5：1，0.8：1，1：1)、经丝裂霉素C处理的同系(C57BL/6)和同种异基因(BALB/c)优势不成熟CD8 α+DC细胞对MLR的抑制作用，同时观察不同浓度的优势不成熟DC2(1×10<'5>/ml，5×10<'5>/ml，1×10<'6>/ml，5×10<'6>/ml)的细胞培养上清对MLR的抑制作用。采用每只BALB/c(H-2<'d>)小鼠尾静脉输注2×10<'6>。红白血病鼠脾细胞的方式进行体内传代，建立EL9611红白血病动物模型并观察其发病情况、生存时间。接种7天后(第0天)行一次性致死性<'60>Co γ射线全身照射，总剂量为8.0Gy，剂量率0.7Gy/分。照射5天前饮用水中开始添加红霉素(终浓度250mg/L)和庆大霉素(终浓度320mg/L)，照射后5小时内每只小鼠尾静脉输注同种异基因C57BL/6(H-2<'b>)小鼠骨髓细胞2×10<'6>+脾细胞1×10<'7>个建立GVHD动物模型，设高(1×10<'6>细胞、n=15)、中(1×10<'5>细胞、n=12)、低(2×10<'4>细胞、n=10)三个剂量组同时输注诱导第3天的供者(C57BL/6，H-2M<'b>)优势不成熟CD8α<'+>DC细胞，观察其对GVHD的预防作用。对照组设：不进行照射的白血病对照组(n=10)、照射后不进行BMT的照射对照组(n=4)、不加优势DC的GVHD对照组(n=10)。观察各组小鼠的临床表现包括精神状态、活动能力、体位改变、皮毛、体重、腹部、大便等、记录每只小鼠的生存时间、计算存活率，生存时间大于60天、观察期结束时无GVHD和白血病征象视为长期存活，部分小鼠观察期大于90天。计数白血病对照组和照射对照组的外周血白细胞数，病理学检查：白血病鼠的血涂片行Giemsa染色观察，各组织经10﹪甲醛固定、石蜡切片、HE染色检查照射对照组的骨髓；白血病对照组的肝、脾；GVHD对照组和优势不成熟DC2高、中、低剂量组的肝、皮肤、小肠；长期存活鼠检查肝、脾、皮肤、小肠；以健康BALB/c鼠作为正常对照。统计分析采用SPSS for Windows 12.0统计软件包进行t检验、方差齐性检验、Kaplan-Meier生存分析和绘制生存曲线，以P<0.05时认为有显著性意义。
结果：
1、小鼠骨髓细胞以4×10<'6>/ml的培养密度加入5 ng/ml GM-CSF，20-ng/mlIL-4，100 ng/ml SCF和25 ng/ml Flt3L诱导后第3天，在CDllc<'+>的DC细胞中可产生97.09﹪的优势CD8 α<'+>DC细胞(浓度为1.45±0.08×10<'6>/ml)，其中MHCⅡ-的不成熟CD8 α<'+>DC占61.77﹪；诱导第7天CD8 α<'+>DC占总DC的60.53﹪(浓度为0.47±0.01×10<'6>/ml)，其中不成熟CD8 α<'+>DC占37.77﹪；诱导第16天CD8 α<'+>DC占总DC的77.78﹪(浓度0.04±0.00×10<'6>/ml)，其中不成熟CD8 α<'+>DC占61.85﹪。随着培养时间的延长，细胞总数先上升后下降，诱导第3天时细胞浓度略高于接种时的浓度，达4.20±0.22×10<'6>/ml，第7天时降低为2.44±0.51×10<'6>/ml，第16天时降为0.34±0.03×10<'6>/ml，第22天为0.34±0.03×10<'6>/ml。免疫荧光、电镜及相差摄影等形态学检查显示所诱导的DC表达CD11c分子并呈现典型树突状细胞的形态特征，培养时呈半悬浮克隆状生长，随培养时间延长越来越多细胞显示出巨噬细胞样形态。各对照组不同时间段的CD8 α<'+>DC/总DC、CD8 α<'+>DC/,总细胞(CD8 α<'+>DC的含量)、不成熟CD8α<'+>DC/总DC比率均低于实验组。不加IL-4的100 ng/ml SCF+25 ng/ml Flt3L+0.4ng/ml GM-CSF对照组细胞总数的变化趋势与实验组基本相同，第16天和第22天的总细胞数高于实验组(P<0.05)，但CD8 α<'+>DC的比例较低、而且数目较少(第3、7、16天CD8 α<'+>DC细胞浓度分别为1.09±0.20×10<'6>/ml、0.08±0.01×10<'6>/ml、0.06±0.00×10<'6>/ml)，表明降低GM.CSF浓度并去除IL-4会减少CD8 α<'+>DC的生成。不加外源性细胞因子的对照组可自发产生一定比例的不成熟CD8 α<'+>DC，但细胞总数较少，不扩增，衰减快，这一趋势在长时间培养时(第7天、第16天)更为明显，而且其CD8 α<'+>DC少于细胞因子诱导组(第3、7、16天CD8 α+DC含量分别为0.71±0.18×10<'6>/ml、0.10±0.04×10<'6>/ml、0.03±0.01×10<'6>/ml)，但短期培养(第3天)仍可获得CD8 α<'+>DC/总DC 91.52﹪，不成熟CD8 α<'+>DC/总DC占62.43﹪的比率，其中CD8 α<'+>DC含量为0.71±0.18×10<'6>/ml，具有一定的应用价值。采用上述方法培养的脾细胞中虽含有优势不成熟DC2细胞，但杂细胞和死细胞多，加入的细胞因子对其不具有诱导和扩增作用(P>0.05)。
2、取米用5 ng/ml GM-CSF,20 ng/ml IL-4，100 ng/ml SCF和25 ng/ml Flt3L诱导第3天的优势不成熟CD8α<'+>DC细胞进行体外功能测定的结果表明，不论是同系还是同种异基因的优势不成熟CD8 α<'+>DC对MLR均具有抑制作用(P<0.05)，并随DC数目的增加抑制作用增强，在DC/反应细胞为1：1左右时达到最大抑制作用。不同浓度的DC培养上清对MLR也有一定的抑制作用(P<0.05)，浓度为5×10<'5>/ml细胞的培养上清显示出最大抑制作用。优势不成熟CD8 α<'+>DC细胞体外激发同系淋巴细胞增殖的能力弱，仅当DC/淋巴细胞大于2：1时方显示出刺激同系淋巴细胞增殖的作用(P<0.05)。
3、优势不成熟CD8 α<'+>DC在GVHD和红白血病动物模型上亦显示出体内可抑制GVHD发生的作用，并且在预防GVHD发生的同时不增加白血病复发的危险。未经照射处理的、接种2×10<'6>个白血病细胞的EL9611红白血病鼠生存时间为14.5±2.1天，死亡率100﹪。