龙眼遗传资源的RAPD与POD同工酶分析

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龙眼是福建重要的亚热带特色水果。然而,人们对龙眼的遗传背景了解甚少,生产上存在的品种老化、良莠不一等突出问题,严重限制了龙眼的资源开发利用和生产的发展。前人应用同工酶、RAPD分析等标记对小样本的龙眼遗传资源进行了初步研究,而在整个有代表性的遗传资源的分析却未见报道。因此有必要应用RAPD分子标记技术结合POD同工酶分析技术对龙眼的遗传资源进行较为全面的遗传资源分析。本研究优化了龙眼POD同工酶提取和电泳体系;摸索出适合龙眼叶片基因组DNA的提取方法;建立和优化了龙眼RAPD反应体系;采用RAPD分子标记技术,辅以POD同工酶分析,结合聚类分析,对以福建龙眼遗传资源为主的95份国内外龙眼遗传资源,进行了遗传资源的遗传多样性和亲缘关系分析。主要研究结果如下: 一、龙眼POD同工酶提取和电泳体系的优化。针对POD同工酶酶的活性和酶带数受到材料新鲜度、提取液的成分、电泳和染色方法的影响,经过反复试验,改进确立了龙眼POD同工酶提取和电泳的优化体系,首次确定供试材料以叶龄为3~6月龄的龙眼叶片为佳,以低浓度的磷酸缓冲液(0.05 mol/L pH7.5的PBS加0.1%的Triton)为宜。同工酶电泳采取聚丙烯酰胺凝胶电泳法,染色方法采用醋酸-联苯胺染色法。改进优化的龙眼POD同工酶提取和电泳的体系,使以往只能获得的POD同工酶酶谱从8条增加到17条。 二、龙眼遗传资源亲缘关系的POD同工酶分析。整个酶谱共产生17条酶带划分为4大酶区。其中第Ⅰ酶区和第Ⅲ酶区是龙眼POD的活性区,在这两个区域的酶带比较固定,且活性大。第Ⅱ酶区和第Ⅳ酶区是龙眼POD的弱性区,所产生的酶带活性较弱。第二条、第三条酶带(迁移率分别为0.220、0.253)是龙眼样品的特征谱带。POD同工酶聚类分析结果把95份龙眼遗传资源分为2个品种类群并细分为7组。 三、龙眼叶片DNA提取方法的建立。针对龙眼叶片富含单宁和多糖的特性,采用两种提取DNA的方法:一种把Tris替代Tris-HCl的改良CTAB法;另一种为加溶解液先除掉可溶性多糖再加入裂解液的改良CTAB法。两种方法都能有效地克服多糖等物质的干扰,更加简便地从龙眼叶片提取较高质量和产量的DNA。 四、龙眼RAPD-PCR反应体系的优化。在参考一般RAPD分析的反应程序的基础上,经过反复试验,确立适宜的PCR扩增程序:94℃预变性5min,94℃1min,38℃40s,72℃2min,共45个循环,最后置4℃保温。优化的龙眼RAPD-PCR反应体系为:25μL反应总体积
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