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【背景】 心肌肥大是心肌受到多种体内外应激因素刺激(如:高血压、瓣膜性心脏病、心肌梗死和心肌病等)时发生的一种代偿性适应性反应。心肌肥大是心血管疾病发生的独立致病危险因素,当心肌过度肥大时容易导致心力衰竭或者其他心脏相关疾病如恶性心律失常和心源性猝死等的发生。因此,抗心肌肥大的药物治疗具有重要的临床意义。目前已经确定具有逆转心肌肥大的药物主要有α1阻断剂哌唑嗪、Ca2+阻断剂尼群地平、血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利等。但这些药物由于疗效或者安全性问题,有其临床局限性。那么,寻找更加安全有效的靶向药物,成为科学工作者亟待解决的关键问题。 泛素-蛋白酶体系统是机体非溶酶体降解主要的蛋白降解通路。大量研究资料显示,泛素-蛋白酶体系统的功能改变与心肌肥大之间关系密切,抑制蛋白酶体功能,可以通过干预Akt,calcineurin/NFAT,MAPK及TGF-β1(thetransforminggrowthfactorβ1)/Smad等多条与心肌肥大相关的信号转导通路,阻止心肌肥大的发生。这将为人们寻找逆转心肌肥大药物提供了明确的思路和线索。研究已证实,蛋白酶体抑制剂PS-519及MG132分别对异丙肾上腺素及主动脉结扎所致的左心肥大具有明显的改善作用。但是目前这些药物由于毒副作用高等原因,仍处于研究阶段。 藤黄酸是中药藤黄的主要成分,具有多种生物学活性如抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗感染等,特别是其抗肿瘤作用研究较多,能够抑制多种肿瘤细胞如MDA-MB-231人乳腺癌细胞、RPMI-8226多发性骨髓瘤、人胃癌BGC-823及MKN-28细胞等的生长,诱导肿瘤细胞的凋亡。本课题组前期对藤黄酸的研究中发现:蛋白酶体是藤黄酸的特异性作用靶点;藤黄酸是一种蛋白酶体抑制剂的前体药物,在体可以通过CYP2E1代谢为具有活性的蛋白酶体抑制剂。既然藤黄酸是一种有效的蛋白酶体抑制剂,那么它能否具有逆转心肌肥大的效应,目前尚不太清楚。 NF-κB是一种可广泛诱导的转录因子,它可激活许多基因的表达,包括与免疫、炎症反应、细胞生存及凋亡、以及细胞周期等有关的基因。在NF-κB通路激活过程中,IκB蛋白发生磷酸化和降解是NF-κB激活、转位入核及刺激基因表达的关键步骤,而这个过程依赖于泛素蛋白酶体系统的激活,然后通过降解IKB从而使NF-κB由胞浆进入细胞核,启动转录。研究表明,NF-κB与心肌肥大相关的信号通路关系密切。并且NF-κB通路的激活是心肌肥大发展过程中必不可少的因素。因此,本课题在探讨藤黄酸对心肌肥大影响的基础上,又观察藤黄酸对NF-κB通路相关分子表达的影响,以揭示藤黄酸的作用机理。 根据前期研究结果,我们提出这样的研究设想:藤黄酸可以通过抑制泛素蛋白酶体的功能,干预NF-κB通路的激活,从而阻止或延缓心肌肥大的发生。为此我们建立了三种心肌肥大动物模型,包括应用异丙肾上腺素导致左心肥大、腹主动脉缩窄所致左心肥大以及长期慢性缺氧所致的右心肥大动物模型。在课题的第一部分,主要探讨了藤黄酸对三种动物模型所致心肌肥大的影响。第二部分探讨了藤黄酸的作用机制,主要是观察藤黄酸对NF-κB通路相关分子表达的影响,为藤黄酸在抑制心肌肥大中的应用提供理论支持。 第一部分藤黄酸对不同因素所致心肌肥大的影响 目的: 探讨藤黄酸对不同因素所致心肌肥大的影响,为藤黄酸非肿瘤学方面的应用提供实验依据。 方法: 本课题建立了三种动物模型,分别是:长期慢性缺氧(氧浓度控制在10％左右,持续21天)所致的右心肥大动物模型;腹主动脉缩窄(0.7mm,持续一周)所致左心肥大以及异丙肾上腺素(30mg/kg/day,皮下注射,持续一周)导致的左心肥大。在缺氧所致心肌肥大模型中,分别应用1mg/kg/dMG132和 0.75mg/kg/d藤黄酸进行干预。在腹主动脉缩窄及异丙肾上腺素所致左心肥大模型,采用藤黄酸1.5mg/kg隔天给药一次进行干预。动物分组:缺氧模型分组为,常氧对照组(Normoxia+Vehicle);常氧+GA/MG132组(Normoxia+GA/MG132);缺氧对照组(Hypoxia+Vehicle);缺氧+GA/MG132组(Hypoxia+GA/MG132)。腹主动脉缩窄模型分组为假手术组(sham组),腹主动脉缩窄组(AAC组)及药物治疗组(AAC+GA组)。异丙肾上腺素模型分组为:对照组(control组),模型组(ISO组)及药物治疗组(ISO+GA组)。实验结束时,分别称量各组大鼠体重、心脏重量用以计算心脏系数(心脏重量/大鼠体重);HE染色观察各组大鼠心脏病理形态学变化;Masson染色观察各组大鼠心脏胶原组织变化;RealtimePCR观察藤黄酸对心肌组织病理性肥大基因α-SK-actin及BNP的影响。 结果: 1.在缺氧所致右心肥大模型中,与常氧对照组相比,缺氧对照组大鼠心脏指数,有显著升高(P<0.05);与缺氧对照组相比,缺氧+GA组心脏指数明显减小(P<0.05),缺氧+MG132组心脏指数同样明显减小(P<0.01)。与常氧对照组相比,缺氧对照组右心指数有明显升高(P<0.01),与缺氧对照组相比,缺氧+GA组右心指数明显减小(P<0.01),缺氧+MG132组右心指数同样明显减小(P<0.05)。腹主动脉缩窄所致左心肥大模型中,与sham组相比,AAC组心脏指数有明显提高(P<0.05),与AAC组相比,AAC+GA组心脏指数出现明显降低(P<0.05)。在异丙肾上腺素所致左心肥大模型中,与control组相比,ISO组心脏指数有明显提高(P<0.01);与ISO组相比,ISO+GA组心脏指数出现明显降低(P<0.01)。 2.光镜下观察HE染色,结果显示,常氧对照组及常氧+GA组心肌细胞核呈蓝色,胞浆呈粉红色,心肌细胞排列正常,间质无明显增生等表现;缺氧对照组可以看到心肌细胞明显呈现明显肥大,心肌纤维变粗,有些心肌纤维排列紊乱、甚至出现断裂;缺氧+GA组较缺氧对照组肥大有所减轻,心肌纤维排列也较为整齐。这一结果通过Masson染色得到了进一步的证明,特别是肥大后胶原组织的增生更加明显,而应用藤黄酸后得到明显的改善。对于主动脉结扎以及异丙肾上腺素所致心肌肥大的模型中,HE染色观察,也可以看到对照组心肌组织心肌细胞排列正常,间质无明显增生等异常的表现;模型组心肌细胞均出现不同程度肥大,肌纤维变粗,排列紊乱等表现;而应用藤黄酸后这种异常的表现得到明显的改善。Masson染色同样可以看到肥大后胶原组织的增生明显,而应用藤黄酸后得到改善的情况。 3.缺氧所致右心肥大模型中,与常氧对照组以及常氧+GA组相比,缺氧后心肌组织α-SK-actin及BNPmRNA的相对表达量明显升高,应用藤黄酸后这两种病理表达基因的mRNA表达明显下降。而对于主动脉结扎以及异丙肾上腺素所致心肌肥大的模型,同样可以观察到模型组出现α-SK-actin及BNPmRNA的相对表达量升高,应用藤黄酸后这两种病理表达基因的mRNA表达下降的情况。结论 藤黄酸对长期慢性缺氧、腹主动脉缩窄以及异丙肾上腺素所致的心肌肥大均具有改善作用。 第二部分藤黄酸逆转心肌肥大的机制研究 目的: 1.观察藤黄酸对肥大心肌组织蛋白酶体chymotrypsin(CT)-like酶活性的影响; 2.探讨藤黄酸对NF-κB通路相关信号分子表达的影响。 方法: 1.荧光酶标仪测定各组肥大心肌组织纯化20S蛋白酶体chymotrypsin(CT)-like酶活性; 2.Westernblot检测各组肥大心肌组织IKBα、蛋白酶体β5亚单位、胞浆胞核P65、细胞因子(IL-2,MCP-1)表达变化; 3.EMSA检测藤黄酸对三种模型所致肥大心肌组织胞核NF-κB与DNA结合活性; 结果: 1.MG132及藤黄酸能够使缺氧后肥大心肌组织纯化20S蛋白酶体chymotrypsin(CT)-like酶活性出现明显下降(P<0.05,P<0.01);同样在主动脉结扎以及异丙肾上腺素致大鼠左心肥大的模型中,我们同样看到了相似的结果,模型组蛋白酶体chymotrypsin(CT)-like酶活性出现升高(P<0.01),应用藤黄酸后,该酶活性出现明显下降(P<0.01)。 2.Westernblot检测结果显示,在缺氧致大鼠心肌肥大模型中,IKBα在缺氧+GA组表达明显增强,而蛋白酶体β5亚单位的表达减弱。在主动脉结扎以及异丙肾上腺素致大鼠左心肥大的模型中,肥大心肌藤黄酸给药组IKBα表达同样出现了增强的趋势,而蛋白酶体β5亚单位的表达减弱的趋势。胞浆胞核P65表达结果显示,藤黄酸作用后,三种模型所致肥大心肌组织胞核中P65表达均出现了不同程度的降低。炎症介质检测结果显示,在缺氧致大鼠心肌肥大模型中,应用藤黄酸后肥大心肌组织IL-2表达明显下降,同样在主动脉结扎以及异丙肾上腺素致大鼠左心肥大的模型中,肥大心肌藤黄酸给药组IL-2,MCP-1表达均出现了下降。 3.EMSA检测三种模型所致肥大心肌组织胞核NF-κB与DNA结合活性,结果显示,应用藤黄酸后,肥大心肌组织NF-κB与DNA结合活性明显降低。 结论: 1.藤黄酸能够降低三种模型肥大心肌组织chymotrypsin(CT)-like酶活性,从而发挥其逆转心肌肥大的效应。 2.藤黄酸逆转心肌肥大的作用与其阻止NF-κB信号转导通路有关。