论文部分内容阅读
黄曲霉毒素B1是诱发肝脏癌变的主要因素之一。ATP合成酶β亚基（ATP5B）除参与机体各种能量代谢外,近些年国内外研究机构纷纷报道ATP5B还参与了肿瘤组织的信号调控。本实验室前期通过蛋白质组学及荧光定量PCR研究分析了ATP5B蛋白与黄曲霉毒素B1诱发的肝癌演化存在相关性（ATP5B发生上调）。本研究制备了分泌抗ATP5B单克隆抗体的杂交瘤细胞株5C4、6G11,为后期研究ATP5B参与黄曲霉毒素B1诱发肝癌的信号调控机制奠定基础。本实验把已构建的质粒载体pET-28a（+）-atp5b和pET-32a（+）-atp5b分别转入原核表达系统E. coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达及Ni2+-NTA亲和层析得到了纯化的ATP5B-Trx、ATP5B蛋白,为制备抗ATP5B单克隆抗体提供了足量的免疫原及ELISA检测所用的包被抗原。以重组蛋白ATP5B-Trx为抗原免疫BALB/c小鼠。经四次免疫后,采用方阵法建立了间接非竞争ELISA检测体系,抗原ATP5B的最佳工作浓度为1:50,即为4.35μg/mL,IgG-HRP的最佳工作浓度为1:20000。之后以此检测系统测定了小鼠血清效价（1A、2A小鼠效价达1:12800,1B、2B小鼠效价只到1:1600和1:6400,3A、3B小鼠效价还低于1:800）,同时采用间接竞争ELISA法评估了6只小鼠血清特异性,最终确定取BALB/c小鼠1A的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合（50% PEG1450）。通过对杂交瘤细胞的筛选及数次亚克隆,最终获得了2株分泌抗ATP5B单克隆抗体的杂交瘤细胞株5C4、6G11,其染色体条数约为98-102,均大于亲本细胞。对杂交瘤细胞5C4、6G11进行传代、定期冻存复苏,检测其分泌抗体效果,结果证明杂交瘤细胞株性质稳定,其细胞培养上清液效价分别为1:800、1:1600。采用小鼠腹内诱生法制备单克隆抗体,经辛酸-硫酸铵法、DEAE-纤维素离子交换柱层析纯化后,此腹水抗体5C4、6G11效价分别为1:5.12×104和1:2.05×105,抗体浓度分别为1.14μg/mL和1.72μg/mL。经SDS-PAGE电泳鉴定抗体纯度,电泳图谱显示了抗体的重链和轻链条带,抗体分子量为150 kDa,抗体纯度均大于90 %。抗体亚类鉴定均为IgG1,亲和力常数分别为1.7×108 L/moL、2.5×108 L/moL,并且通过Western-blot证实了此抗体的高度特异性。