论文部分内容阅读
目的：建立高效液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)测定血清支链氨基酸(branched-chain amino acids,BCAAs)、芳香族氨基酸(aromatic amino acids,AAAs)、谷氨酸(glutamate,Glu)、谷氨酰胺(glutamine, Gln)、溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholines,LPCs)、肉毒碱(carnitine,CO)和酯酰肉毒碱(acylcarnitines,AcyCNs)的方法,研究各代谢物与心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)传统危险因素、糖尿病(diabetes mellitus,DM)、颈动脉内中膜厚度(carotid intima-media thickness,cIMT)和颈动脉斑块的关系。方法： 用标准溶液建立各代谢物液相色谱分离和质谱测定的条件。用含0.1%甲酸的异丙醇提取血清各目标代谢物,氮气下吹干,用流动相重组后进行LC-MS/MS分析,用同位素内标法定量,评价方法的线性、检测限(Limits of detection,LOD)、定量限(limits of quantification,LOQ)、基质效应、不精密度和样品稳定性。征集600名体检志愿者,记录年龄、性别、身高、体重和血压等基本信息,用所建LC-MS/MS方法测定血清各代谢物,同时测定血糖、血脂、超敏C反应蛋白(high sensitivity C-reactive protein, hsCRP)和血肌酐(creatinine,Crea)等CVD传统危险因素,超声检测cIMT和颈动脉斑块,分析各代谢物与CVD传统危险因素、DM、cIMT和颈动脉斑块的关系。结果： 液相色谱分离采用HILIC色谱柱,流动相为75%乙,腈(0.5%甲酸,7.5mM甲酸铵,PH=3.0),柱温20℃,流速0.25ml/min,进样4μl。在API 4000质谱,电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI)多反应监测(multiple reaction monitor, MRM)模式下,所有代谢物在5.5分钟内有效分离。方法的相对回收率在86.07%-107.58%。平均批内不精密度在5%以内,总不精密度大多在10%以内。血清样品各代谢物浓度在-80℃存储6个月后没有显著变化。各代谢物的水平与CVD危险因素的偏相关分析显示,校正年龄、性别和体重指数(body mass index, BMI)后,BCAAs.苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)、色氨酸(tryptophan,Trp)和Glu与甘油三酯(triglyceride,TG)显著正相关(P<0.001),与高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和载脂蛋白AI(apolipoprotein AI,ApoAI)显著负相关(P<0.01);Gln/Glu与TG和载脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)显著负相关(P<0.001),与HDL-C和ApoAI显著正相关(P<0.001)；饱和LPC(16:0 LPC和18：0 LPC)与TG、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和ApoB显著正相关(P<0.001),不饱和LPC(18:1 LPC和18：2 LPC)与HDL-C和ApoAI显著正相关(P<0.001)。通过方差分析和Logistic回归分析,各代谢物与BMI的关系显示,BCAAs、AAAs、Glu、C0、丙酰肉毒碱(propionyl-L-carnitine,C3)和戊酰肉毒碱(valeryl-L-carnitine,C5)与BMI显著正相关(P<0.001);Gln、 18:1 LPC、18:2 LPC与BMI显著负相关(P<0.001);与糖尿病的关系显示,BCAAs、 Phe、Glu、乙酰肉毒碱(acetylcarnitine,C2)和C5水平在糖尿病组显著高于非糖尿病组(P<0.05),Gln/Glu在糖尿病组显著低于非糖尿病组(P<0.001)；与cIMT和颈动脉斑块的关系显示,颈动脉内中膜增厚组BCAAs(P<0.001)和C5(P<0.01)水平显著高于正常组；斑块组大多数AcyCN水平显著高于无斑块组(P<0.05),C0和AcyCN类代谢物水平是颈动脉斑块产生的独立危险因素(OR=1.897,P<0.05)。结论：本研究建立了LC-MS/MS测定血清氨基酸、LPC、C0和AcyCN类等25种代谢物的方法,所建方法简便、快捷、可靠,可作为CVD组学研究和临床流行病研究的有效工具。用所建方法测定600例体检志愿者,发现各代谢物与多种CVD传统危险因素、DM、cIMT和颈动脉斑块等相关,可能是潜在的CVD危险预示指标。