论文部分内容阅读
第一部分 WAS基因突变位点与临床表型的相关性分析 目的：探讨28例WAS基因突变患者突变位点与临床表型的相关性。 方法：收集苏州大学附属儿童医院血液科2013年1月-2018年2月发现WAS基因突变的28例病人的临床资料，按照突变热点及临床表型进行归类分析。 结果：患儿均为男性，发病中位年龄1 (0-83)个月，突变体共检出24种，其中新发突变9种，包括c.1234_1235dupCC，c.1093-1097delG，c.28-30dupC，c.436G>T，c.273+10_273+11dupCC，c.995_996insG，c.1010T>A，c.332_333delCC，c.683C>T。临床表型包括经典WAS 24例，其突变类型包括错义突变、剪接体突变、插入突变、缺失突变、无义突变；X连锁的血小板减少症（XLT）1例由错义突变引起；1例间歇性X连锁的血小板减少症（IXLT）由剪接体突变引起；X连锁的全血细胞减少症（XLP）共2例，是由错义突变引起。IXLT患者丙种球蛋白及激素治疗有效，且能持续缓解；XLT患者丙种球蛋白、激素治疗血小板一过性有效；经典WAS患者丙种球蛋白或激素治疗仅少部分患者血小板一过性有效（8.3%）；XLP患者丙种球蛋白、激素治疗血小板低下状态无改善。淋巴细胞亚群检测发现CD3+降低患者占60.9%，CD19+降低患者占13.0%，CD56+16+降低患者占17.3%。本研究中23例接受造血干细胞移植(HSCT)，存活21例，放弃HSCT的病人5例，4例死亡，只有1例IXLT的病人存活。 结论：WAS基因缺陷是WAS及相关疾病确诊的重要依据。少数病人丙种球蛋白+激素治疗一过性有效，需要鉴别诊断。HSCT是治疗WAS的最有效手段。 第二部分WASP P460S突变与骨髓衰竭相关性研究 目的：探讨WASP P460S突变与骨髓衰竭的相关性。 方法：2例表现为骨髓衰竭的患儿，通过骨髓衰竭基因panel检测寻找致病基因并通过一代测序验证，通过SWISS-MODEL软件预测WAS基因C1378T突变对WAS蛋白结构的影响。Western blot方法检测患者骨髓细胞中WASP的表达以及不同细胞株中WASP的表达情况，进而筛选出合适的细胞株构建稳转细胞。通过PCDH-CMV-GFP-flag载体和Plu-CMV-MCS-iGFP慢病毒载体分别构建WASP-WT，WASP-S272P，WASP-P460S质粒，肌动蛋白聚合实验验证WASP P460S突变对肌动蛋白聚合的影响。慢病毒包装构建稳定表达WASP-WT和WASP-P460S的K562细胞，CellTilte-Glo试剂盒分别检测24h，48h，72h，96h后稳转细胞增殖速率的变化，比较K562-WASP-WT与K562-WASP-P460S细胞增殖速率的差异。分别以0，0.5，1，2，4μg/ml浓度的MTX，CTX，DNR处理K562-WASP-WT和K562-WASP-P460S细胞，24h后CellTilte-Glo试剂检测细胞的存活率。用Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒处理细胞后，在流式细胞仪上检测细胞的凋亡情况；碘化丙啶染色试剂盒处理细胞后，用流式细胞仪分析细胞周期的变化；用40nM TPA诱导细胞24h后，在流式细胞仪上检测CD41的表达对比细胞分化情况。Western blot方法检测凋亡相关蛋白PARP的变化。 结果：一代测序验证了二代测序发现的结果，即两名骨髓衰竭的患者存在 WAS基因C1378T突变，引起WASP P460S改变。患者WAS基因C1378T突变为纯核突变，其母亲为携带者，突变遗传自母亲。蛋白质三维结构构件未见P460S突变引起蛋白质结构明显的改变。Western blot结果表明：患者骨髓细胞中存在WAS蛋白（WASP），与正常人相比未见明显下降，但不同于经典型WAS患者中WASP表达缺失或明显减少；K562细胞不表达WASP。细胞增殖实验发现，K562-WASP-P460S细胞增殖速率与K562-WASP-WT细胞相比明显减慢，提示P460S突变与骨髓衰竭相关；三种临床常用化疗药物MTX，CTX，DNR处理K562-WASP-WT和K562-WASP-P460S细胞24小时后，CellTilte-Glo检测发现两种细胞的存活率无明显差异；流式检测结果表明，两种细胞正常培养和加药处理后，细胞的凋亡情况均无明显差异；细胞周期结果也未见明显的阻滞现象；诱导分化实验中，两种细胞表面CD41的表达情况也无明显差异；0.5，1，2μg/ml 的DNR处理两种细胞24小时后，c-PARP的表达量无明显差异。但肌动蛋白聚合实验中WASP P460S突变能够引起肌动蛋白聚合增加。 结论：WASP P460S突变阻滞细胞增殖，促进肌动蛋白聚合作用，可能与骨髓衰竭相关，提示这可能是一个新的激活突变。但该突变引起的细胞增殖受到阻滞不是通过影响细胞凋亡、分化或周期阻滞实现的，需要进一步探讨。