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目的：观察以慢病毒作为载体,介导增强型绿色荧光蛋白(lenti-EGFP)这一报告基因,通过两种方式体内转染大鼠角膜基质细胞的有效性和安全性,探索一种简便,有效且安全的转染载体及途径,为角膜相关疾病的基因治疗提供实验基础。
方法：Lenti-EGFP通过两种不同方法体内转染大鼠角膜基质细胞,途径1:将Lenti-EGFP病毒液通过微量进样器直接注射进角膜基质;途径2:刮除角膜上皮,基质层敷贴浸带有等量lenti-EGFP病毒液的棉片。转染后定期裂隙灯检查,观察角膜绿色荧光的表达及外眼情况,以3d、7d、26d、48d四个不同时间点收集角膜,固定后切片,进行HE染色,观察角膜各层细胞的大体形态;共聚焦显微镜观察拍照,了解角膜荧光表达的强度、持续时间及分布情况;电镜观察基质细胞超微结构的变化;细胞凋亡检测,了解试验组与对照组角膜细胞凋亡情况。
结果：⑴裂隙灯古兰光下见转染lenti-EGFP的活体大鼠角膜成蓝绿色,对照组角膜未见荧光表达。⑵HE染色显示各组别大鼠角膜的各层细胞形态未发生明显异常改变,电镜见实验组角膜基质细胞的超微结构未发生变异。⑶共聚焦显微镜下观察见:转染lenti-EGFP的角膜基质细胞2d后增强型绿色荧光蛋白(EGFP)开始表达,7d时荧光表达到高峰,全层角膜均可见荧光表达,26d时表达明显减弱,48d时仅是上皮有微弱表达;空质粒组在第3d和7d时角膜上皮及基质层问可见微弱荧光,基质细胞中无荧光表达,26d和48d时角膜已无荧光表达;对照组的全层角膜在各时间段均未见荧光表达。⑷Tunel检测发现实验组的角膜上皮及基质细胞凋亡率较正常组高,但与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
结论：Lenti-EGFP通过上述两种体内转染途径均可安全有效的转染活体大鼠角膜基质细胞。在转染初期,注射法的EGFP基因表达更强,随着时间的延长两种方式的荧光强度趋于相同,但基质注射途径仍略强于刮除上皮敷贴棉片这种方式。两种技术操作简便、基因转染快速,且转染效率较高、安全性好,为各种原因导致的角膜病变,尤其是对抑制准分子激光术后角膜Haze形成及板层角膜移植术后的排斥反应等转基因治疗提供了新思路。