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瓜子金为远志科植物Polygala japonica Houtt.的干燥全草,是民间广泛使用的中草药,《中华本草》记载该药材用于祛痰止咳、活血消肿等。现代医学研究报道,该药材具有抗炎、抗肿瘤、抗抑郁等药理作用。在瓜子金成药研究中,我们发现市场上流通的瓜子金药材含量多数不合格,但药材仍在广泛流通使用,且使用者反应其清热解毒等疗效很好。因此,对瓜子金药材的基源、成分和药效进行深入全面的研究对于该药材及其成方制剂的开发利用具有重要意义。目的:为了更全面地分析瓜子金药材的成分,建立瓜子金药材多成分分析的高效液相色谱法和UPLC-Q-TOF-MS法。对多批瓜子金药材的成分进行深入分析和比较,根据不同的化学成分预测瓜子金药材的抗肿瘤作用靶点,进而对瓜子金成分进行分离纯化。方法:(1)按照现行瓜子金质量标准,对从市面上购得的12批瓜子金药材进行检验。同时,为了分析瓜子金药材的更多成分,通过筛选供试品溶液的不同制备方法、色谱条件,建立了可测定三个皂苷(瓜子金皂苷V、瓜子金皂苷己、瓜子金皂苷XXXI)含量的高效液相色谱法:甲醇超声制备供试品溶液,十八烷基硅烷键合硅胶为固定相、乙腈-甲醇(90:10)为流动相A、0.3%甲酸为流动相B、梯度程序洗脱和ELSD作为检测器。采用该方法重新对12批瓜子金药材进行检验。并采用聚类分析主成分分析法比较三种皂苷在不同药材部位中的含量分布差异。(2)采用UPLC-Q-TOF-MS法分析两类药材的化学成分及其裂解规律,代表批号分别为170110和180306,色谱条件:固定相为C18色谱柱,流动相A为乙腈-甲醇(90:10),流动相B为0.3%甲酸,梯度洗脱;质谱条件为电喷雾离子源(ESI),正、负离子模式监测,数据采集范围m/z为300-2000。(3)采用Chemdraw和Schrodinger 2018软件描述药材成分的分子信息,通过与Lipinski规则、系统药理学和参考文献的所要求的成药性原则进行比较,预测化合物的药效基团。同时,寻找肿瘤发生、形成过程中的蛋白分子。采用PPI网络分析、GO和KEGG富集分析法预测化合物药效基团和蛋白分子的相互作用位点、功能和通路。(4)筛选并建立了瓜子金两类药材(代表批号170110和180306)的组分分离方法。采用50%乙醇超声提取药材,75%、90%乙醇分级沉淀药材提取物,多溶剂依次(石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇)萃取,取乙酸乙酯萃取液和水饱和正丁醇萃取液分别采用大孔树脂柱层析分离药材中化学成分。同时,采用薄层色谱及方法1中的高效液相色谱法分析提取、纯化、分离过程各产物的成分。结果:(1)按瓜子金现行质量标准检验药材,12批药材中仅有4批的瓜子金皂苷己含量合格。同时,采用新方法检验,按液相图谱中成分保留时间的集中度不同,将药材分为两类,主要成分保留时间在5-35min的为第一类,40-68min的为第二类。新建立的高效液相色谱法经方法学验证,测定三种皂苷含量准确可行。采用该方法测定的三种皂苷,其中瓜子金皂苷己的含量与采用现行瓜子金质量标准方法测定结果一致。不同药材部位的三种皂苷含量和分布差异结果为瓜子金皂苷Ⅴ、瓜子金皂苷己的含量:叶>茎>根,瓜子金皂苷XXXI:根>叶>茎。(2)通过液质分析两类药材,结果如下:第一类药材主要含31个化合物,包括18个皂苷(瓜子金皂苷V、瓜子金皂苷己、瓜子金皂苷XXXI、瓜子金皂苷II、Astragalin、Tenuifolin等)、6个黄酮(Polygalin C、Polygalin B等)、4个糖脂和3个酮。第二类药材主要含30个化合物,包括10个皂苷(瓜子金皂苷XXXI、瓜子金皂苷E、瓜子金皂苷J、瓜子金皂苷XXI)、10个糖脂(Tenuifoliose F、Tenuifoliose A、Tenuifoliose L)、6个黄酮(Polygalin C、Polygalin B等)、3个酮、1个苯丙素。同时,我们发现皂苷类的保留时间普遍比黄酮类较短。在反相色谱中,由于皂苷类极性较大,与固定相的亲和力较差,流动相可较快洗脱这类成分,所以保留时间较短。而黄酮类,由于母核极性较小,与固定相的亲和力较好,所以保留时间较长。(3)通过网络药理学方法预测两类药材的抗肿瘤作用靶点,结果如下:第一类药材的17个成分成药性较好,通过MMP2、IGF1、KIT等19个靶点发挥抗肿瘤作用。19个靶点影响到186个基因本体(Gene ontology,GO)生物过程,如生物调节、代谢和应激,主要富集在趋化因子、PI3K-Akt代谢通路、NOD-like受体信号通路等。第二类药材的16个成分成药性较好,通过KIT、JAK3、SRC等12个靶点发挥抗肿瘤作用。12个靶点影响到150个基因本体GO生物过程,如生物调节、细胞信号转导等,主要富集在雌激素信号、癌症代谢通路、内分泌抵抗受体信号通路等。(4)通过提取、纯化、分离两类药材,获得了含成分较多的两个纯化产物。两个纯化产物分别为180306批次药材的水饱和正丁醇萃取液经大孔树脂纯化的40%-80%乙醇洗脱液,主要为皂苷类成分;170110批次药材的乙酸乙酯萃取大孔树脂纯化的60%-80%乙醇液。主要为黄酮类成分。结论:本研究通过建立药材分析方法、分析药材成分、预测药材化学成分的抗肿瘤作用靶点和初步纯化分离药材成分,更全面地认识到药材的化学成分信息。按液相检出成分保留时间的成分集中度不同,将药材分为两类。对比出两类药材的共有成分21个,包括瓜子金皂苷II、紫云英苷、Polygalin C等;差异成分17个,包括瓜子金皂苷X、瓜子金皂苷XLVII、瓜子金皂苷丁等。其中,两类药材中的瓜子金皂苷XXI、瓜子金皂苷II、Polygalin C、Polygalin B等,结构相似,可能具有类似的活性。同时,测定了不同药材中3种皂苷含量,发现叶中含瓜子金皂苷己较多,且可能与不同药用部位相关。综上所述,在瓜子金成药研究中,药材中多个成分具有药理活性,可作用于多个靶点。一方面,体现了瓜子金药材多成分-多靶点-多活性的抗肿瘤作用特点。该特点为综合研究瓜子金药理学特征提供了新思路和新方法。另一方面,本研究说明仅以瓜子金皂苷己作为含量测定指标进行药材质控是不够严谨的,本研究提出了更合理的药材成分分析方法,为完善质量标准提供参考意见。