【摘 要】
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胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的病原菌,每年给全球养猪业造成巨大的经济损失。本研究旨在利用大肠杆菌外膜囊泡(OMVs)递呈
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胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的病原菌,每年给全球养猪业造成巨大的经济损失。本研究旨在利用大肠杆菌外膜囊泡(OMVs)递呈APP GalT蛋白,并对其免疫效果进行研究,初步探索其作为新型候选疫苗的潜力。首先,成功构建了能表达APP GalT蛋白的重组大肠杆菌。以大肠杆菌JC8031作为表达菌,pBAD18-Cm作为表达载体,先后将clyA(909bp)和galT(1050bp)基因片段连入载体中,经终浓度为0.2%L-阿拉伯糖诱导5h后,重组大肠杆菌能够表达由ClyA和GalT组成的融合蛋白,大小约为75KD。其次,成功建立了递呈APP GalT蛋白的大肠杆菌OMVs制备方法。诱导20h后的重组大肠杆菌首先经低速离心分离上清,随后使用分子截留量为100KD的超滤管对上清液进行浓缩,再经120,000×g超速离心3h分离沉淀后得到大肠杆菌外膜囊泡悬液。分离到的大肠杆菌外膜囊泡直径在20-150nm之间;Western-blotting鉴定显示重组外膜囊泡中APP GalT蛋白。最后,证明了递呈APP GalT蛋白的OMVs具有较好的APP免疫保护效果。以重组外膜囊泡免疫小鼠,对其进行了体液免疫、细胞免疫、攻毒保护率及病理变化等方面的评价。结果显示免疫后的小鼠可以产生高效价的特异性IgG抗体(1:204800);淋巴细胞增殖水平和细胞因子分泌水平显著上升;攻毒试验结果表明在主动免疫和被动免疫中重组外膜囊泡可分别起到87.5%和50%的保护率;肺脏病理分析和免疫组织化学结果显示重组外膜囊泡可明显减轻小鼠攻毒后肺脏病变程度和中性粒细胞浸润情况。
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