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目的:研究中药软骨利有效成分(HBP-A)对体外培养的软骨细胞生物学性状的影响,并观察HBP-A干预可注射性藻酸盐水凝胶和软骨细胞复合体系后的形态学表现,进而探讨复合体系在动物体内的生物学状况和特点。以期进行中药成分应用于软骨组织工程领域的探索。
方法:采用酶消化法体外培养兔关节软骨细胞并以特异性II型胶原免疫组化染色进行细胞鉴定。采用不同浓度的HBP-A干预体外细胞培养体系,在第1、3、5、7和9天以MTS法观察细胞增殖能力,在第5天观察细胞增殖并用酶联免疫检测法检测上清糖氨多糖的分泌状况；采用0.3mg/ml浓度的HBP-A干预体外细胞培养体系,分别以酶联免疫检测法和RealtimePCR观察细胞上清基质金属蛋白酶3的分泌和Aggrecane、ADAMTS-5基因表达。
采用扫描电镜观察藻酸盐水凝胶与软骨细胞复合后的形态学状况。当HBP-A干预藻酸盐水凝胶和软骨细胞复合体系并注射入6周龄的裸鼠体内6周后,进一步采用病理切片、透射电镜对复合物进行观察,并以RT-PCR方法研究复合物的可聚蛋白聚糖和II型胶原的表达状况。
结果:特异性II型胶原免疫组化染色鉴定证实培养的细胞为软骨细胞；在细胞增殖的不同时间点,0.6-1.2mg/ml浓度区间的HBP-A对细胞增殖有抑制作用,在0.075-0.3mg/ml浓度区间则未观察到明显促细胞增殖和分泌GAG的作用。但在0.3mg/ml浓度时,表现出较好的抑制细胞分泌MMP-3的作用,并对ADAMTS-5基因表达有抑制作用。
不同层面的形态学研究发现,经HBP-A干预的藻酸盐水凝胶和软骨细胞复合体系可在裸鼠皮下形成类软骨组织复合物,并可观察到复合物内的胶原明显增多。进而以RT-PCR证实,与不干预中药的对照组比较,复合物内的可聚蛋白聚糖的基因表达未见明显差异0.59[95％CI=0.40,0.78]vs0.50[95％CI=0.28,0.71](P>0.05),但II型胶原的基因表达明显增强0.80[95％CI=0.67,0.93]vs0.49[95％CI=0.45,0.53](P<0.05)。
结论: HBP-A干预软骨细胞与藻酸盐水凝胶复合体系后,可以发现类软骨组织形成,其在软骨组织工程中的作用靶点可能与抑制相关降解酶、增加组织II型胶原的表达有关,在此领域的应用研究值得进一步深入。