论文部分内容阅读
我国是胃癌的高发国家，每年新增胃癌患者超过30万，约占全球新发病例的1/3，胃癌是我国肿瘤患者的第二大死亡原因。我们研究发现超过60%的胃癌患者初诊时已存在淋巴结转移，5%的患者存在脏器如肝脏等转移，而最终超过90%的胃癌患者死于转移及其并发症。因此，研究我国独特的胃癌发病和转移机制，探寻影响胃癌发生和发展密切相关的关键分子和通路，对于了解我国胃癌的生物学特性、丰富胃癌治疗手段并提高胃癌患者生存期具有极其重要的理论意义和应用价值。目的：1）探讨ADAMs在胃癌中的表达谱系；探讨FoxM1调控ADAM17的作用机制及其生物学功能；分析FoxM1和ADAM17在胃癌中表达及预后价值；为胃癌的诊断、治疗及预后判断提供可能的新的靶点。2）初步探讨二甲双胍对FoxM1-ADAM17轴表达的影响，为二甲双胍的临床运用提供新的理论和实验依据。方法：1）RT-PCR、Western blot检测胃癌细胞株和组织中具有蛋白水解酶活性的跨膜型ADAMs的表达，筛选出高表达的ADAMs家族成员，采用siRNA选择性下调其表达，观察胃癌细胞生物学行为的改变。2）RT-PCR、Western blot检测胃癌细胞和组织中FoxM1和ADAM17表达的相关性。过表达或下调表达FoxM1，观察胃癌细胞中ADAM17mRNA和蛋白表达水平的改变，并研究其对胃癌细胞增殖、侵袭及成瘤性的影响。3）Luciferase检测转染不同浓度FoxM1后，胃癌细胞ADAM17启动子区的活性改变，并通过CHIP（染色质免疫共沉淀）实验验证二者是否存在直接物理结合。4）免疫组化检测胃癌组织芯片中FoxM1和ADAM17的表达，分析二者在胃癌中的共表达率，及其与临床病理参数和预后之间的关系。5）Western blot检测不同浓度二甲双胍处理后胃癌细胞中pAMPK及其下游mTOR通路相关的信号蛋白以及FoxM1和ADAM17的蛋白表达改变；MTT法检测胃癌细胞增殖能力的改变；荷瘤鼠成瘤实验研究二甲双胍对胃癌细胞成瘤性的影响。结果：1）胃癌组织中具有蛋白水解酶活性的跨膜型ADAMs家族成员ADAM9、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM28和ADAM33在胃癌组织中的mRNA表达水平升高，ADAM12表达水平下调。ADAM10、ADAM17和ADAM28在肿瘤组织中的蛋白表达明显高于癌旁正常组织，采用sh-RNA选择性下调ADAM10、ADAM17、ADAM28的表达，可抑制胃癌细胞的增殖。2）FoxM1和ADAM17在胃癌细胞和胃癌组织中的表达具有相关性。采用3*flag-FoxM1上调MKN45细胞中FoxM1表达，ADAM17的mRNA和蛋白表达水平也随之上调,MKN45的增殖能力提高；采用sh-RNA下调SGC7901细胞中FoxM1表达，可抑制细胞中ADAM17的mRNA和蛋白表达水平，并抑制SGC7901细胞的增殖能力。荷瘤鼠成瘤实验表明，采用FoxM1-shRNA干扰SGC7901细胞后，SGC7901的体内成瘤能力下降，瘤体中FoxM1和ADAM17的蛋白表达水平下调；采用3*flag-FoxM1上调MKN45细胞中FoxM1表达水平，MKN45细胞的成瘤性增强；共转染3*flag-FoxM1和ADAM17shRNA后，MKN45细胞的成瘤性较单纯转染组下降，但仍高于空白对照组。3）在MKN45和293T细胞株中转染不同浓度的FoxM1质粒，随着转染质粒浓度的增加，ADAM17启动子活性逐渐升高。转染5ng FoxM1质粒组，ADAM17启动子活性明显高于转染2.5ng组和未转染组，组间比较具有统计学差异（P＜0.05）。在SGC7901和293T细胞株中采用不同浓度的shRNA抑制FoxM1的表达，随着FoxM1表达水平的下调，ADAM17启动子活性逐渐下降。采用5ng shRNA抑制FoxM1表达组，ADAM17启动子活性明显下调，与0ng组相比具有显著统计学差异（P＜0.05），提示FoxM1可调节ADAM17转录活性。CHIP结果显示：FoxM1与ADAM17启动子区存在物理性结合。4）FoxM1和ADAM17在胃癌组织中的表达水平均明显高于癌旁正常组织，其中FoxM1的阳性率为58.7%(121/206)， ADAM17的阳性率为75.7%（156/206）。二者共表达率为50.48%（104/206）。FoxM1高表达与浸润深度、淋巴结转移明显相关(P<0.05)，与TNM分期以及肿瘤组织分化程度显著相关(P<0.001)。ADAM17高表达与年龄相关(P<0.05)，与淋巴结转移以及TNM分期显著相关(P<0.01)。FoxM1和ADAM17高表达的胃癌患者总生存期明显低于低表达的患者，两者之间具有显著统计学差异(FoxM1：中位生存时间46.9m vs76.1m, P<0.001)(ADAM17：中位生存时间53.0m vs78.1m, P<0.001)。COX多因素回归分析显示，FoxM1以及ADAM17高表达是判断胃癌患者预后的危险因素之一。5）体外实验研究表明，采用不同剂量二甲双胍处理，胃癌细胞N87和MKN45细胞的增殖能力与二甲双胍的使用呈剂量依赖性下调，其中50mM组增殖力下降最为显著，与0mM组相比具有显著统计学差异（P<0.001）。荷瘤鼠成瘤实验显示，采用二甲双胍处理的治疗组，种植瘤生长过程中瘤体直径明显低于对照组，二者比较有显著差异(P<0.01)。处死后测量瘤体体积和重量，结果显示，治疗组的瘤重和瘤体积均低于对照组，差异趋势较为明显（P=0.0961和P=0.0916）。提示二甲双胍能抑制胃癌细胞的生长，抑制荷瘤鼠的成瘤能力。在对二甲双胍作用机制的体外实验研究中发现，随着二甲双胍浓度的上升，胃癌细胞N87和MKN45中pAMPKα的表达水平逐渐上升，而AMPK下游的mTOR及其信号通路蛋白pS6、p4EBP1的蛋白表达水平与二甲双胍的使用呈剂量依赖性下调。荷瘤鼠瘤体的免疫组化检测也显示，二甲双胍治疗组pAMPKα的蛋白表达水平高于对照组，p-mTOR、pS6和p4EBP1的表达水平均明显低于对照组。治疗组反应细胞增殖能力的cyclinD1蛋白表达水平也低于对照组。同时，我们研究了给予不同剂量二甲双胍处理对胃癌细胞中FoxM1和ADAM17表达的变化情况，结果提示在胃癌细胞中，FoxM1和ADAM17的表达水平与二甲双胍的用量呈剂量依赖性下调。结论：1）FoxM1和ADAMs在胃癌细胞和胃癌组织中表达水平升高，选择性抑制二者的表达可抑制胃癌细胞的增殖和荷瘤鼠成瘤能力。2）FoxM1可与ADAM17启动子区结合，直接调控ADAM17的表达，进而影响其生物学行为。3)FoxM1和ADAM17在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，并且与胃癌的不良预后相关，可作为胃癌的独立预后指标之一。4）二甲双胍可以从体内外抑制胃癌细胞的增殖，其作用机制可能与抑制FoxM1-ADAM17活性有关。