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角膜新生血管可继发于多种角膜疾病(如感染、外伤、营养不良等)及全身性疾病(如重型红斑、糖尿病、免疫性疾病等),是角膜对缺氧、炎症等多种刺激因素综合的病理反应,可导致角膜移植时的排斥反应,严重影响患者视力的恢复。角膜血管化是眼科医生一直以来面临的一个十分棘手的难题,如何治疗新生血管形成是当前眼科研究的一个热点。
本论文旨在通过对角膜新生血管和炎症的发生、预防和治疗机制的研究,解决角膜术后免疫排斥反应的关键问题,发现治疗角膜新生血管的新途径。
轴突导向因子Netrins是一类结构高度保守的分泌型蛋白质分子,对中枢、外周神经细胞及新生血管的迁移具有吸引或排斥的双重导向作用。这种双重导向作用可通过其所表达的不同受体被激活:吸引作用需轴突上DCC家族受体;排斥作用需要UNC5H家族受体,Netrins与它们结合导致轴突排斥及血管回退。
在本论文中,我们采用碱烧伤动物模型进行体内实验。利用RT-PCR和蛋白免疫印记分析方法所检测的Netrin-1及其受体的表达情况显示,Netrin-1和UNC5B的表达趋势一致,正常角膜组织中高表达,碱烧伤后降低,点药后升高。Western blot结果显示,Netrin-1和UNC5B在正常大鼠角膜组织上皮中高表达,基质中低表达。通过荧光素钠染色,裂隙灯拍照显示,Netrin-1可以促进碱烧伤大鼠角膜上皮修复。TUNEL法的实验结果则显示,Netrin-1可以抑制碱烧伤大鼠角膜细胞的凋亡。在预防和治疗实验中,Netrin-1均可以有效的抑制和回退角膜新生血管。对碱烧伤后1、3、5、7天的对照组和Netrin-1处理组的角膜组织进行了PMN和ED1荧光染色发现,在第五天开始差异显著,Netrin-1处理组明显少于对照组。进一步利用蛋白质免疫印迹分析方法对其机理进行深入研究发现,VEGF/PEDF信号通路可能在维持角膜新生血管方面发挥着重要作用。上述研究结果表明,Netrin-1是一种潜在的内源性角膜新生血管抑制剂,是治疗角膜新生血管的一种新途径。
本文还研究了Netrin-1同一家族的另一个成员Netrin-4在碱烧伤大鼠角膜新生血管的作用。体外实验以HUVEC为研究对象,研究了Netrin-4对HUVEC的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响,结果表明Netrin-4对HUVEC的增殖、迁移和侵袭有双重作用,低浓度促进而高浓度抑制;对HUVEC的凋亡来讲,低浓度起抑制作用而高浓度起促进作用。这表明Netrin-4对血管内皮细胞也具有双重作用。基于高浓度可以抑制血管内皮细胞增殖、迁移和侵袭作用的事实,本论文开展了动物活体实验。实验中仍然采用碱烧伤动物模型,很好地再现了炎症性角膜新生血管的病理特征。预防和治疗实验的结果均显示,Netrin-4在高浓度条件下可以有效地抑制和回退角膜新生血管。机理研究表明,这可能和VEGF/PEDF信号通路相关。上述结果表明,高浓度Netrin-4对角膜新生血管具有潜在的治疗作用。
总之,轴突导向因子Netrin-1和Netrin-4在碱烧伤诱导的角膜新生血管的预防和治疗中均起着显著的作用,并可以起到抗炎的作用。