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目的:丁苯酞具有改善局部脑缺血区微循环和血流量,保护线粒体的结构和功能,缩小脑梗塞面积,减轻脑水肿等作用。在临床上,丁苯酞广泛用于治疗缺血性脑血管病,并作为脑血管病后改善智能和功能恢复的首选用药。从发病机制上看,脑血管病的发生与脂类代谢密切相关,其中甘油三酯代谢异常是脑血管病发生的重要因素之一。目前国内对丁苯酞与甘油三酯代谢的研究尚少见报道。有必要进一步研究丁苯酞对甘油三酯代谢的影响,以期在日后应用丁苯酞治疗脑缺血性疾病中,指导临床合理用药。
基因芯片(Gene chip)又称DNA芯片(DNA chip),是一种新型的基因功能分析技术,具有高通量、微型化和自动化的特点,成为后基因组时代基因功能分析的最重要技术之一。基因芯片的基本原理是碱基互补配对和分子杂交,是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定于支持物上,然后与待测的标记样本基因按碱基配对原理进行杂交,再通过激光共聚焦荧光显微镜检测系统等对芯片进行扫描,并配以计算机系统对荧光信号做出比较和检测,从而迅速得出所要的信息。基因芯片技术的优点在于无需先前知道测试样品中靶基因的作用情况,可同时观察成千上万个基因表达的结果,高效、快速、多参量地对基因进行检测,从整体基因表达谱水平研究疾病。本研究对利用基因芯片技术获得的不同剂量丁苯酞作用下,在不同用药时间点大鼠肝脏基因数据的观察,筛选出有意义基因,对其表达变化情况进行深入分析,从分子生物学水平掌握丁苯酞对甘油三酯代谢的影响,为临床合理用药提供帮助。
方法:1数据取得情况实验大鼠12组,用不同剂量的丁苯酞灌胃3天、10天、20天、灌胃10天停药10天。基因芯片分配:一倍剂量组4片;两倍剂量组4片;四倍剂量组4片。对杂交后的基因芯片通过共聚焦显微镜扫描取得扫描数据。
2整理数据将已取得的不同剂量、不同时间点丁苯酞喂养大鼠后获得的12个rat_384基因芯片检测数据Excell文件进行整理。
3筛选甘油三酯代谢相关基因找出甘油三酯代谢相关基因得出比值,并汇总为一个甘油三酯代谢相关基因比值Excell文件。
4找出甘油三酯代谢中有意义基因从甘油三酯代谢相关基因比值Excell文件中找出影响甘油三酯代谢的关键基因。
结果:丁苯酞喂养大鼠后用大鼠rat_384基因芯片检测,获得4096个基因和表达序列,从中找出影响甘油三酯代谢的关键基因5个AF021348(线粒体甘油-3-磷酸脂酰转移酶)、NM_012597(肝脂肪酶)、NM_017075(乙酰辅酶A乙酰转移酶1)、BC087036(极长链脂酰辅酶A脱氢酶)、NM_001004085(肉碱乙酰转移酶),具体分析这几个基因随用药剂量及用药时间发生上调或下调而引起其表达变化的情况。
1一倍剂量(60mg/kg/day)用药3天有意义基因表达变化情况AF021348、NM_012597、BC087036、NM_001004085比值在正常范围。NM_017075受到影响,上调超出正常范围。
2一倍剂量(60mg/kg/day)用药10天有意义基因表达变化情况AF021348、NM_012597、NM_017075、BC087036、NM_001004085这5个基因比值皆在正常范围。其中,NM_017075在此用药状态下,下调到正常范围。
3一倍剂量(60mg/kg/day)用药20天有意义基因表达变化情况NM_012597、NM_017075、BC087036、NM_001004085与此药物剂量下用药10天的情况相似,基因变化在正常范围。而此时AF021348呈明显上调趋势。
4一倍剂量(60mg/kg/day)用药10天停药10天有意义基因表达变化情况AF021348比值进一步增高,基因上调更加明显。NM_012597比值超过正常范围,基因呈上调表观。BC087036在此用药状态下首次发生变化,下调到正常范围之下。NM_001004085、NM_017075比值仍在正常范围,未再出现有意义变化。
5两倍剂量(120mg/kg/day)用药3天有意义基因表达变化情况AF021348、NM_017075比值超过正常范围,基因呈上调变化。NM_012597、BC087036、NM_001004085比值在正常范围。
6两倍剂量(120mg/kg/day)用药10天有意义基因表达变化情况NM_017075比值仍在正常范围之上,但上调幅度较两倍剂量用药3天有所下降,与一倍剂量用药10天比较其处于上调变化。其余四个基因AF021348、NM_012597、BC087036、NM_001004085比值皆在正常范围。
7两倍剂量(120mg/kg/day)用药20天有意义基因表达变化情况所有五个基因AF021348、NM_012597、NM_017075、BC087036、NM_001004085比值皆在正常范围,无上调、下调变化。
8两倍剂量(120mg/kg/day)用药10天停药10天有意义基因表达变化情况所有五个基因AF021348、NM_012597、NM_017075、BC087036、NM_001004085继续保持稳定,无上调、下调变化。
9四倍剂量(240mg/kg/day)用药3天有意义基因表达变化情况NM_012597比值明显降低,基因下调明显,是该基因所有观察组中首次下调且下调幅度较大。NM_017075比值明显升高,基因上调明显。其余三个基因AF021348、BC087036、NM_001004085比值在正常范围,无上调、下调变化。
10四倍剂量(2400mg/kg/day)用药10天有意义基因表达变化情况NM_017075比值仍在正常范围之上,基因继续保持上调变化,但上调幅度较四倍剂量用药3天时降低。其余四个基因AF021348、NM_012597、BC087036、NM_001004085比值在正常范围,无上调、下调变化。
11四倍剂量(240mg/kg/day)用药20天有意义基因表达变化情况所有观察的五个基因AF021348、NM_012597、NM_017075、BC087036、NM_001004085在此用药剂量和时间点,比值在正常范围,无基因上调、下调变化。
12四倍剂量(240mg/kg/day)用药10天停药10天有意义基因表达变化情况所有观察的五个基因AF021348、NM_012597、NM_017075、BC087036、NM_001004085比值仍在正常范围,基因表达稳定。
结论:大鼠口服丁苯酞后,通过rat384芯片可以观察到肝脏在不同用药剂量、不同用药时间点众多基因上调或下调的变化。从中研究与甘油三酯代谢相关的有意义基因5个,得出其在不同剂量、多个时间点变化表达对甘油三酯代谢的影响和在各个用药阶段某些药物、疾病、机体功能状态等对基因表达产物的影响。
丁苯酞一倍剂量应用早期,NM_017075基因上调而其余四个基因保持稳定,肝脏生酮作用和肝外解酮作用增强,有利于降低甘油三酯。后期AF021348、NM_012597基因上调,甘油三酯生成和降解相互作用;且伴有:BC087036基因下调,甘油三酯降解受抑制;NM_001004085基因一直保持稳定有利于维持正常的细胞功能。综上所述,丁苯酞应用后期,甘油三酯可能有升高趋势,应注意检测血脂和考虑基础疾病的影响,合理配伍用药。
基因芯片(Gene chip)又称DNA芯片(DNA chip),是一种新型的基因功能分析技术,具有高通量、微型化和自动化的特点,成为后基因组时代基因功能分析的最重要技术之一。基因芯片的基本原理是碱基互补配对和分子杂交,是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定于支持物上,然后与待测的标记样本基因按碱基配对原理进行杂交,再通过激光共聚焦荧光显微镜检测系统等对芯片进行扫描,并配以计算机系统对荧光信号做出比较和检测,从而迅速得出所要的信息。基因芯片技术的优点在于无需先前知道测试样品中靶基因的作用情况,可同时观察成千上万个基因表达的结果,高效、快速、多参量地对基因进行检测,从整体基因表达谱水平研究疾病。本研究对利用基因芯片技术获得的不同剂量丁苯酞作用下,在不同用药时间点大鼠肝脏基因数据的观察,筛选出有意义基因,对其表达变化情况进行深入分析,从分子生物学水平掌握丁苯酞对甘油三酯代谢的影响,为临床合理用药提供帮助。
方法:1数据取得情况实验大鼠12组,用不同剂量的丁苯酞灌胃3天、10天、20天、灌胃10天停药10天。基因芯片分配:一倍剂量组4片;两倍剂量组4片;四倍剂量组4片。对杂交后的基因芯片通过共聚焦显微镜扫描取得扫描数据。
2整理数据将已取得的不同剂量、不同时间点丁苯酞喂养大鼠后获得的12个rat_384基因芯片检测数据Excell文件进行整理。
3筛选甘油三酯代谢相关基因找出甘油三酯代谢相关基因得出比值,并汇总为一个甘油三酯代谢相关基因比值Excell文件。
4找出甘油三酯代谢中有意义基因从甘油三酯代谢相关基因比值Excell文件中找出影响甘油三酯代谢的关键基因。
结果:丁苯酞喂养大鼠后用大鼠rat_384基因芯片检测,获得4096个基因和表达序列,从中找出影响甘油三酯代谢的关键基因5个AF021348(线粒体甘油-3-磷酸脂酰转移酶)、NM_012597(肝脂肪酶)、NM_017075(乙酰辅酶A乙酰转移酶1)、BC087036(极长链脂酰辅酶A脱氢酶)、NM_001004085(肉碱乙酰转移酶),具体分析这几个基因随用药剂量及用药时间发生上调或下调而引起其表达变化的情况。
1一倍剂量(60mg/kg/day)用药3天有意义基因表达变化情况AF021348、NM_012597、BC087036、NM_001004085比值在正常范围。NM_017075受到影响,上调超出正常范围。
2一倍剂量(60mg/kg/day)用药10天有意义基因表达变化情况AF021348、NM_012597、NM_017075、BC087036、NM_001004085这5个基因比值皆在正常范围。其中,NM_017075在此用药状态下,下调到正常范围。
3一倍剂量(60mg/kg/day)用药20天有意义基因表达变化情况NM_012597、NM_017075、BC087036、NM_001004085与此药物剂量下用药10天的情况相似,基因变化在正常范围。而此时AF021348呈明显上调趋势。
4一倍剂量(60mg/kg/day)用药10天停药10天有意义基因表达变化情况AF021348比值进一步增高,基因上调更加明显。NM_012597比值超过正常范围,基因呈上调表观。BC087036在此用药状态下首次发生变化,下调到正常范围之下。NM_001004085、NM_017075比值仍在正常范围,未再出现有意义变化。
5两倍剂量(120mg/kg/day)用药3天有意义基因表达变化情况AF021348、NM_017075比值超过正常范围,基因呈上调变化。NM_012597、BC087036、NM_001004085比值在正常范围。
6两倍剂量(120mg/kg/day)用药10天有意义基因表达变化情况NM_017075比值仍在正常范围之上,但上调幅度较两倍剂量用药3天有所下降,与一倍剂量用药10天比较其处于上调变化。其余四个基因AF021348、NM_012597、BC087036、NM_001004085比值皆在正常范围。
7两倍剂量(120mg/kg/day)用药20天有意义基因表达变化情况所有五个基因AF021348、NM_012597、NM_017075、BC087036、NM_001004085比值皆在正常范围,无上调、下调变化。
8两倍剂量(120mg/kg/day)用药10天停药10天有意义基因表达变化情况所有五个基因AF021348、NM_012597、NM_017075、BC087036、NM_001004085继续保持稳定,无上调、下调变化。
9四倍剂量(240mg/kg/day)用药3天有意义基因表达变化情况NM_012597比值明显降低,基因下调明显,是该基因所有观察组中首次下调且下调幅度较大。NM_017075比值明显升高,基因上调明显。其余三个基因AF021348、BC087036、NM_001004085比值在正常范围,无上调、下调变化。
10四倍剂量(2400mg/kg/day)用药10天有意义基因表达变化情况NM_017075比值仍在正常范围之上,基因继续保持上调变化,但上调幅度较四倍剂量用药3天时降低。其余四个基因AF021348、NM_012597、BC087036、NM_001004085比值在正常范围,无上调、下调变化。
11四倍剂量(240mg/kg/day)用药20天有意义基因表达变化情况所有观察的五个基因AF021348、NM_012597、NM_017075、BC087036、NM_001004085在此用药剂量和时间点,比值在正常范围,无基因上调、下调变化。
12四倍剂量(240mg/kg/day)用药10天停药10天有意义基因表达变化情况所有观察的五个基因AF021348、NM_012597、NM_017075、BC087036、NM_001004085比值仍在正常范围,基因表达稳定。
结论:大鼠口服丁苯酞后,通过rat384芯片可以观察到肝脏在不同用药剂量、不同用药时间点众多基因上调或下调的变化。从中研究与甘油三酯代谢相关的有意义基因5个,得出其在不同剂量、多个时间点变化表达对甘油三酯代谢的影响和在各个用药阶段某些药物、疾病、机体功能状态等对基因表达产物的影响。
丁苯酞一倍剂量应用早期,NM_017075基因上调而其余四个基因保持稳定,肝脏生酮作用和肝外解酮作用增强,有利于降低甘油三酯。后期AF021348、NM_012597基因上调,甘油三酯生成和降解相互作用;且伴有:BC087036基因下调,甘油三酯降解受抑制;NM_001004085基因一直保持稳定有利于维持正常的细胞功能。综上所述,丁苯酞应用后期,甘油三酯可能有升高趋势,应注意检测血脂和考虑基础疾病的影响,合理配伍用药。