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目的： 原发性肝癌是严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤之一，目前我国肝癌患者死亡率居高不下。根据现有认识，慢性肝损害刺激肝细胞过度增殖是肝细胞肝癌发生的主要病理机制之一。热休克蛋白(heat shock Protein，HSP)又称应激蛋白，广泛存在于原核、真核细胞中，进化上高度保守。在HSP家族中，HSP70亚族在细胞内的含量最多，免疫原性最强，因此成为研究的重点。我们认为HSP70作用的多样性，除了与受到的应激刺激多样和分布的细胞种类有关外，主要与HSP70在组织中的分布位置有关。根据HSP70在组织中的不同分布，可以将其分为细胞内HSP70和细胞外HSP70。在某些病理状态下，如肿瘤进展或炎症反应中，细胞内HSP70及HSP70肽复合物（HSP70-Peptide Complexes，HSP70-PCs）可以通过分泌、胞吐和细胞破裂、坏死而被释放到细胞外。释放到细胞外的HSP70/HSP70-PCs能调控肿瘤的多种生物学行为，包括增殖，侵袭等。但是，细胞外HSP70/HSP70-PCs是跨膜转导的机制目前尚不清楚。Toll样受体(TLRs)是一类天然免疫受体家族，在机体的固有免疫反应中起重要作用。TLRs能够识别不同外源性刺激并将信号进一步进行转导。在肿瘤的发生发展过程中，肿瘤细胞释放大量物质，包括HSP70、TNF-α等。现已发现包括肝癌细胞在内的多种肿瘤细胞表面均有TLRs的表达。那么在肝癌细胞中，细胞外HSP70/HSP70-PCs是否通过TLRs介导的跨膜作用发挥其功能？细胞外HSP70/HSP70-PCs又是通过哪些转导通路实现细信号的细胞内转导，进而活化转录因子调节肿瘤细胞的增殖？本研究我们首先检测肝癌组织中TLRs的表达情况，然后研究细胞外HSP70/HSP70-PCs刺激前后肝癌细胞增殖的改变，探讨TLRs信号转导活化途径。 方法： 1、应用MTT对比细胞外HSP70/HSP70-PCs刺激前后肝癌细胞株增殖的改变。然后阻断TLR2与TLR4检测细胞外HSP70/HSP70-PCs对肝癌细胞增殖的影响。 2、应用western blot与real-time RT-PCR检测细胞外HSP70/HSP70-PCs对TLR2、TLR4表达的影响;应用免疫共沉淀、GST Pull Down与放线菌酮检测HSP70与TLR2、TLR4之间的关系。 3、利用western blot检测和对比HSP70/HSP70-PCs刺激前后肝癌细胞JNK1/2、Cyclin D1蛋白的表达情况。然后检测阻断JNK1/2后HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌细胞株Cyclin D1蛋白的表达情况。 结果： 1、细胞外HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌细胞HepG2后明显促进肝癌细胞增殖，而同时阻断TLR2与TLR4能抑制细胞外HSP70/HSP70-PCs对肝癌细胞的促增殖作用。 2、细胞外HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌细胞HepG2后TLR2、TLR4蛋白mRNA与蛋白明显增加;细胞外HSP70/HSP70-PCs能够与TLR2、TLR4形成复合物并上调其稳定性发挥其作用。 3、细胞外HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌细胞HepG2后p-JNK1/2、Cyclin D1表达明显增加，阻断JNK1/2后Cyclin D1表达明显降低。 结论： 1、细胞外HSP70/HSP70-PCs促进肝癌细胞增殖是通过与TLR2、TLR4形成复合物并上调其稳定性发挥作用。 2、细胞外HSP70/HSP70-PCs通过TLR2、TLR4跨膜后进一步通过JNK1/2进行信号转导活化Cyelin D1实现其对肝癌的增殖。