论文部分内容阅读
【研究目的】有关病原体感染在支气管哮喘(bronchial asthma,asthma)发病中的研究越来越受到重视,在临床观察中发现在非典型病原体、真菌和一些细菌感染后支气管哮喘的发病率上升和急性发作程度加重。其中肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae)感染与支气管哮喘的关系最引人关注的。目前肺炎支原体是公认的支气管哮喘患儿稳定期和急性发作的一个重要的协同因素,这些患儿在运用大环内酯类抗生素治疗肺炎支原体感染后可明显改善肺功能和减轻呼吸系统症状。树突状细胞(dendritic cell,DC)及其TOLL样受体(toll-like receptors,TLR)和T辅助细胞亚群(T helper cell,Th)在支气管哮喘合并MP感染时起核心作用。本研究目的在于:(1)观察支气管哮喘患儿是否存在肺炎支原体感染的高发生率,分析肺炎支原体感染与其他临床过敏指标间是否存在一定关系?评估肺炎支原体感染是否是支气管哮喘患儿发病的一个协同因素。(2)检测树突状细胞及其TOLL样受体在支气管哮喘合并MP感染时的变化,分析它们在支气管哮喘合并MP感染时的作用。(3)检测T辅助细胞1(T helper 1,Th1)、T辅助细胞9(T helper 9,Th9)、T辅助细胞17(T helper 17,Th17)的细胞因子IFN-γ、IL-9和IL-17在支气管哮喘合并MP感染时的变化,分析MP感染后是否通过影响哮喘发病相关细胞因子而发挥作用。(4)通过检测哮喘MP感染动物模型肺组织的T-box转录因子(T-box expressed in T cells,T-bet)、GATA结合蛋白3抗体(Transcription factor GATA-3,GATA-3)和核因子-КB(Nuclear factor-КB,NF-κB)转录因子的水平,从基因水平初步分析MP感染与哮喘发病之间的关系。【研究方法】1.运用ELISA和皮肤点刺实验等方法对支气管哮喘患儿进行MP血清学检测和过敏相关的指标测定,包括血清总Ig E、螨特异性Ig E、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophilic cationic protein,ECP)和过敏原皮试等,分析在支气管哮喘患儿中MP感染率及与过敏指标的相关性。2.将支气管哮喘患儿按照MP血清学检测结果分为MP感染组与非感染组,同时通过构建哮喘MP感染的小鼠动物模型,运用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定患儿外周血、小鼠模型外周血、肺脏和脾脏细胞中DC及其Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)、TLR4、TLR5和TLR6的表达情况。3.运用双抗体夹心ELISA方法对患儿外周血和哮喘动物模型肺泡灌洗液(Broncho Alveolar Lavage Fluid,BALF)及外周血进行白介素9(interleukin 9,IL-9)、白介素-17(interleukin-17,IL-17)、γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)细胞因子的检测,分析各组患儿和不同模型组的差异,探讨MP感染后细胞因子网络的变化。4.运用荧光半定量PCR方法检测动物模型各组肺组织T-bet,GATA-3和NF-κB的表达差异,从哮喘相关的转录因子水平初步分析MP感染时这些主要转录因子的变化。【结果】1、入选的支气管哮喘患儿中,MP感染率为44.74%;其他呼吸道感染患儿的MP感染率为23.08%;正常对照组为7.14%,由此可见支气管哮喘患儿的MP感染率明显高于正常对照组,也高于其他呼吸道感染的患儿。哮喘MP感染患儿组总Ig E、s Ig E、ECP分别为977.4±101.6IU/ml,39.93±7.14IU/ml,87.83±14.43ug/L;过敏原皮试结果以常见的螨类过敏原皮试结果分析,+-++比例为54.55%,++以上比例为45.45%;而哮喘非MP患儿组总Ig E、s Ig E、ECP分别为332.2±69.15IU/ml,9.72±3.65IU/ml,41.57±6.41ug/L;过敏原皮试结果分析+-++比例为68.18%,++以上为31.82%。结果显示哮喘患儿组MP感染率高于其他各组,有显著差异;提示哮喘时可能存在MP易感性,MP感染组和非感染组的血清总Ig E、s Ig E和ECP有明显差异(P<0.01),提示哮喘MP感染组患儿过敏状态较非MP组严重。2、22例哮喘MP感染组患儿、22例哮喘非MP感染患儿和17例正常对照组外周血DC及其TLR2、TLR4、TLR5和TLR6的表达情况和动物模型各组外周血、肺和脾脏组织中DC及其TLR2、TLR4、TLR5和TLR6的表达情况(1)哮喘MP感染组患儿、哮喘非MP感染患儿和正常对照组外周血DC细胞比例分别为0.82±0.13%,0.79±0.11%,0.40±0.09%,其中MP感染组和非MP感染组与对照组之间有显著差异(P<0.05),而MP感染组与非感染组之间无明显差异,提示MP感染可能并不影响DC数目。(2)在哮喘MP感染组患儿外周血DC中以TLR2和TLR4表达升高为主,提示MP感染时可能经DC表面的TLR2和TLR4受体介导参与哮喘发病。(3)哮喘MP感染患儿组、哮喘非MP感染组和正常对照组中,哮喘MP感染患儿组TLR2表达为70.30±5.84%,TLR4表达为54.97±5.65%,而非MP感染组分别为为48.59±7.86%,38.08±5.56%;正常对照组分别为24.35±4.70%,19.98±5.13%,哮喘MP感染患儿组与哮喘非MP感染组有显著差异(P<0.05);哮喘MP感染患儿组与正常对照组之间有非常显著差异(P<0.01);而各组TLR5和TLR6表达无明显差异;(4)哮喘MP感染小鼠模型组、非感染组和对照组外周血、肺脏和脾脏组织中DC细胞比例分别为0.49±0.02%,0.45±0.05%,0.14±0.01%;0.61±0.06%,0.79±0.13%,0.37±0.06%;0.97±0.15%,1.09±0.23%,0.26±0.05%,显示MP感染组外周血、肺脏和脾脏中DC细胞比例较正常对照组增高,有显著差异(P<0.01),而MP感染组与非感染组之间无明显差异,提示MP感染可能并不影响DC数目,与患儿外周血结果一致。(5)哮喘MP感染小鼠模型组、非感染组和对照组外周血、肺脏组织中DC以TLR2和TLR4表达升高为主,而正常对照组的外周血、肺脏和脾脏组织中TLR分布无差异;三组的脾脏组织中四种TLR分布无差异。(6)哮喘MP感染小鼠模型组、非感染组和对照组外周血中DC及其表面TLR2表达分别为87.00±3.64%,55.84±3.72%,31.03±4.15%;TLR4表达分别为73.75±4.36%,48.46±3.04%,25.15±1.86%;TLR5表达分别为10.71±0.30%,11.10±0.67%,18.06±3.91%;TLR6表达分别为11.17±0.12%,12.93±1.22%,18.47±3.65%,其中哮喘MP感染小鼠模型组TLR2和TLR4表达和非MP感染模型组及正常对照组均有显著差异(P<0.01);TLR5和TLR6表达各组间无差异;肺脏组织中表达与外周血一致;而在各组的脾脏组织中四种TLR表达均未发现有明显差异;以上结果与临床哮喘患儿检测结果基本相符,进一步证实TLR2和TLR4在儿童支气管哮喘合并MP感染发病中的重要性,MP感染可能通过DC表面TLR2和TLR4介导而发挥作用。3、22例哮喘MP感染组患儿、22例哮喘非感染患儿和17例正常对照组血浆IL-9水平分别为213.8±46.04pg/ml,105.9±13.50pg/ml,57.65±7.50pg/ml,哮喘MP感染组患儿和非感染患儿及正常对照组间均有显著差异(P<0.01);IL-17水平分别为42.50±13.52pg/ml,51.90±14.55pg/ml,22.16±4.39pg/ml,各组间无明显差异;IFN-γ水平分别为19.20±4.47pg/ml,22.90±3.85pg/ml,93.05±37.55pg/ml,哮喘MP感染组患儿与正常对照组间有显著差异(P<0.05);同时哮喘MP感染模型组、非MP感染模型组和对照组的肺泡灌洗液IL-9水平分别为567.8±23.11 pg/ml、212.8±21.70pg/ml、115.3±5.50pg/ml;哮喘MP感染模型组和非MP感染组和正常对照组间均有显著差异(P<0.01);IL-17水平分别为34.51±20.37pg/ml,23.35±3.19pg/ml,56.40±17.71pg/ml;各组间无显著差异;IFN-γ水平分别为15.49±1.71pg/ml,35.07±0.62pg/ml,55.35±1.21 pg/ml;哮喘MP感染模型组和非MP感染组及正常对照组间均有显著差异(P<0.01);其中血浆IL-9水平分别为567.8±23.11 pg/ml、212.8±21.70pg/ml、115.3±5.50pg/ml,哮喘MP感染组模型和非MP感染组及正常对照组间均有显著差异(P<0.01);IL-17水平分别为8.410±0.92pg/ml,15.45±6.66pg/ml 12.51±3.98pg/ml,各组间无明显差异;IFN-γ水平分别为19.20±4.47pg/ml、22.90±3.85pg/ml、93.05±37.55pg/ml,哮喘MP感染模型组与正常对照组间有显著差异(P<0.01);提示在MP感染后IL-9水平明显升高,IFN-γ水平则明显下降,存在Th1/Th9的偏移。4、哮喘MP感染模型组、哮喘非MP感染模型组和对照组肺组织T-bet表达分别为6.012±1.67,5.25±0.75,127.4±27.04;GATA-3表达分别为0.36±0.02,0.29±0.02,0.10±0.00;NF-κB的表达分别为9.95±1.36,3.89±1.23,0.58±0.18,其中哮喘MP感染模型组的GATA-3和NF-κB的表达明显高于其他两组,具有非常显著差异(P<0.01);T-bet表达明显低于正常对照组,有非常显著差异(P<0.01)。【结论】1、支气管哮喘患儿的MP感染率高于一般呼吸道感染患儿和正常对照组,提示支气管哮喘患儿可能存在MP的易感性,MP感染在支气管哮喘发病中可能是一个协同因素。2、哮喘MP感染患儿和哮喘MP感染模型的DC及其TOLL受体的研究提示TLR2和TLR4与MP感染参与的支气管哮喘的发病有密切关系,提示在MP病原体感染时,可能通过DC表面的TLR2和(或)TLR4而激活系列信号传导通路。3、哮喘MP感染患儿T细胞亚群的细胞因子的研究结果表明,在MP感染后血浆IL-9水平明显升高,IFN-γ水平则明显下降,IL-17水平无明显变化,说明MP感染后导致Th1/Th9偏移;在哮喘MP感染模型的研究中IL-9水平在动物模型肺泡灌洗液和血浆中都明显升高,进一步证实IL-9在MP感染支气管哮喘中的核心作用,MP感染可能导致Th1/Th9偏移。4、与T细胞亚群相关的转录因子T-bet、GATA-3和NF-κB研究结果提示,MP感染后支气管哮喘模型肺组织GATA-3和NF-κB表达明显升高,提示在MP感染后通过影响与Th2相关的转录因子而在哮喘发病中起一定作用。