论文部分内容阅读
选择性栓塞肿瘤组织血管从而诱发肿瘤组织的缺血性坏死是一种很有前景的抗肿瘤策略。利用导向载体构建载体-tTF融合蛋白,将截断的组织因子tTF选择性靶向于肿瘤组织血管膜表面,可以诱发肿瘤组织血管栓塞,阻断肿瘤营养物质和氧气的供给,引发肿瘤缺血性坏死,发挥抗肿瘤作用。Neuropilin-1（NRP-1）是相对分子质量（Mr）为120-130 kDa的跨膜糖蛋白,被发现在肿瘤内皮细胞和肿瘤细胞上都有高表达。Neuropilin-1是血管内皮生长因子165（VE GF165）的非酪氨酸激酶受体,它的过表达与肿瘤血管新生和生长相关,因此NRP-1可能成为抗肿瘤治疗的靶点。Haiyan Jia等设计出的短肽EG3287,可以与Neuropilin-1发生特异性结合,EG3287是VEGF165的一个片段,它保留了与NRP-1结合的能力,但不会触发细胞内的信号通路,为此我们用EG3287作为靶向载体构建融合蛋白tTF-EG3287,选择性地诱导肿瘤血管栓塞。为了获得重组tTF-EG 3287基因及有活性的蛋白产物,我们利用PCR技术构建了EG3287与tTF的融合基因,克隆基因至原核表达载体pET 32b（+）,IPTG诱导表达,通过优化其表达条件,实现目的蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达,结果发现目的蛋白以包涵体形式表达,用镍亲和层析柱纯化目的蛋白,透析法进行复性。凝血实验和FⅩ活化实验证实融合蛋白保留tTF部分活化FⅩ和引发血液凝固的的活性;免疫荧光实验的结果显示,融合蛋白tTF-EG3287能使ECV304细胞膜带上红色荧光,而等摩尔浓度的tTF蛋白不能,说明融合蛋白的EG3287部分保持了生物活性,能与ECV304细胞发生特异性结合。体内实验显示融合蛋白tTF-EG32 87能有效抑制鼠源性肉瘤S180的生长,在S180小鼠模型中,tTF-EG3287的抑瘤率可达到64.6%。组织学观察发现融合蛋白能选择性定位于肿瘤组织,并选择性诱发肿瘤组织血管栓塞,导致肿瘤细胞坏死,而对正常组织没有毒副作用。总之,我们通过基因工程技术成功地构建了tTF-EG3287的融合基因,并在原核表达体系获得高效表达。融合蛋白tTF-EG3287具有显著的选择性诱发肿瘤组织血管栓塞的活性与抑制肿瘤生长的作用,这些为给肿瘤血管靶向治疗提供新的药物奠定了基础。