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HAMLET(Humanα-LactalbuminMadeLethaltoTumorCells,肿瘤杀伤性人α乳清蛋白)是熔球态构象的人α乳清蛋白与油酸的复合物,具有选择性杀伤转化细胞、某些胚胎细胞和淋巴细胞的效应,而对分化成熟的细胞没有显著毒性。原发的神经胶质瘤具有高侵润性,与正常脑组织混合,手术困难;放、化疗后可出现凋亡抵抗和耐药,其中伴随细胞自噬的发生,但具体途径及其与疗效的关系不清。HAMLET在某种程度上类似于错误折叠蛋白质在细胞内的聚合物,其作用和机制的复杂性可能与对蛋白酶体和自噬系统的多重影响有关。关于HAMLET的肿瘤选择性杀伤机制存在多种假说,除细胞凋亡外,蛋白酶体抑制、细胞自噬的激活、以及核转运后与组蛋白和染色质的相互作用等均有报道,其中与自噬的关系备受重视且存在一些争议。最近的研究显示p62/SQSTM1作为细胞内泛素-蛋白酶体系统和自噬.溶酶体系统的桥梁分子,在蛋白降解和更新过程中发挥重要作用,并参与调节决定细胞生死的自噬和凋亡途径。因此深入探讨HAMLET对p62/SQSTM1的影响,对于揭示其杀伤神经胶质瘤的自噬相关机制具有重要的理论意义和应用价值。
目的:
本研究以神经胶质瘤研究的标准细胞系U87MG为模型,利用重组技术建立和优化HAMLET的简易批量制备方法,并围绕p62/SQSTM1的定量、定位与表达干预,探讨HAMLET对细胞自噬和蛋白酶体系统的影响及其相关分子机制。
方法:
1、通过在大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达C端融合His标签的人α乳清蛋白,经复性和纯化后,将其与OA复合制备重组HAMLET,并通过ANS实验及细胞活性实验对HAMLET的结构和活性进行鉴定。
2、以神经胶质瘤细胞系U87MG为研究对象,通过HAMLET的浓度梯度和时效性实验及细胞活性实验筛选其最佳浓度及引起细胞死亡的作用时间。通过TUNEL和Calcein-AM/PI法检测HAMLET可引起U87MG细胞的凋亡及发生凋亡的时间。
3、通过对HAMLET作用的U87MG细胞的透视电镜观察,GFP-LC3的荧光观察和p62,LC3蛋白的检测,判断自噬是否在HAMLET作用后U87MG细胞中出现。
4、在特异性自噬抑制剂(3MA),溶酶体抑制剂(NH4Cl),饥饿条件(EBSS),自噬激活剂雷帕霉素或自噬相关基因Atg5的基因干扰等预先处理条件下,通过MTS法和Calcein-AM/PI法分析自噬抑制或激活以及p62蛋白水平的变化对HAMLET引起U87MG细胞死亡的影响。
5、通过20S蛋白酶体糜蛋白酶活性试验,HAMLET与蛋白酶体抑制剂MG-132联合的细胞毒性试验以及HAMLET作用后细胞内蛋白泛素化水平的检测,分析HAMLET对U87MG细胞蛋白酶体的作用。
6、通过MTS试验检测U87MG细胞p62过表达或沉默或UBA突变对HAMLET细胞毒性的影响,同时对HAMLET作用后细胞中的GFP-p62进行跟踪观察,并对Caspase-8的活性进行检测,分析p62在HAMLET引起Ug7MG细胞死亡中的作用。
结果:
1、结构分析显示HAMLET比HLA,OA的结构更松散,暴露更多的疏水键;细胞毒性试验显示在HeLa细胞中,HAMLET的细胞毒性显著高于HLA和OA;在不同的细胞系中,HAMLET能杀伤肿瘤细胞系U87MG,A549,H1299,小鼠巨噬细胞RAW264.7,未分化成熟的小鼠前脂肪细胞3T3-L1而对分化成熟的仓鼠卵巢细胞CHO和原代培养的小鼠神经胶质细胞则无毒性作用。
2、HAMLET可通过凋亡途径最终引起神经胶质瘤细胞U87MG细胞死亡。细胞毒性试验结果显示HAMLET可引起U87MG细胞剂量和时间依赖性死亡。TUNEL结果显示HAMLET可以引起U87MG细胞凋亡而HLA和OA不能,而Calcein-AM/PI法结果显示100μg/mlHAMLET在6h时以后引起U87MG细胞的凋亡。
3、U87MG细胞在HAMLET作用下出现了自噬。透射电镜结果显示HAMLET组比对照组的U87MG细胞中出现更多的自噬体,GFP-LC3的荧光图像结果显示HAMLET引起GFP-LC3阳性细胞增多,Westernblotting结果显示LC3Ⅱ的转变随HAMLET作用的时间和剂量的增加而增加。
4、U87MG细胞自噬水平的抑制或激活影响HAMLET的细胞毒性。MTS和Calcein-AM/PI结果显示3MA和siAtg5对细胞自噬的抑制和EBSS诱导的自噬增强了HAMLET对U87MG细胞的细胞毒性,Westernblotting结果显示HAMLET组的p62表达显著高于对照组。同时,细胞毒性试验显示NH4C1或雷帕霉素对细胞自噬的抑制或激活减弱了HAMLET对U87MG细胞的细胞毒性。Westernblotting结果显示HAMLET组的p62表达显著低于对照组
5、HAMLET可抑制20S蛋白酶体的活性,而HAMLET将增加蛋白酶体抑制剂对U87MG细胞的细胞毒性。20S蛋白酶体糜蛋白酶活性试验结果显示HAMLET能显著抑制20S蛋白酶体糜蛋白酶活性。同时,Westernblotting结果显示HAMLET增强了细胞内蛋白的泛素化,而MTS实验结果显示HAMLET显著增强蛋白酶体抑制剂MGl32的细胞毒性。
6、HAMLET引起U87MG细胞的死亡随细胞内p62表达的增高而增多,HAMLET在细胞内能促进p62形成了聚集体,这些聚集体通过UBA结构域吸附大量泛素化的Caspase-8,从而激活凋亡途径引起肿瘤细胞的死亡。GFP-p62的荧光观察显示HAMLET作用后的U87MG细胞比对照组中的p62形成更多的聚集体,细胞毒性试验显示HAMLET作用后的U87MG细胞活性,p62过表达组比对照组,sip62组,p62-UBA突变组显著降低,sip62组,p62-UBA突变组则比p62过表达组和对照组显著增高。另外,HAMLET能引起U87MG细胞内Caspase-8的活性增强。
结论:
1.通过重组技术,成功建立和优化了HAMLET的快速、简易和规模化制备方法。
2.发现和确认了HAMLET引起的U87MG细胞凋亡过程中自噬的存在,自噬的变化对HAMLET细胞毒性的影响以及HAMLET对蛋白酶体活性的抑制。
3.发现p62/SQSTM1介导了HAMLET肿瘤杀伤作用中的自噬,探讨了HAMLET引起p62/SQSTM1的聚集进而激活凋亡途径的机制以及上述作用对p62/SQSTM1分子内UBA功能域的依赖性。