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目的:复发性口腔溃疡(Recurrent Oral Ulcer,ROU)是一种较为常见的、病因尚不明确的口腔黏膜类疾病。本论文开发了一种小分子纳米水凝胶的新型材料,此材料是新一代基于超分子自组装原理的小分子纳米水凝胶药用载体材料,利用新一代纳米凝胶剂型承载蜂胶治疗口腔溃疡的有效成分,制备治疗口腔溃疡药物蜂胶的新剂型。通过深入研究,明确所选二组份小分子物质自组装作用机理及外界条件等对其自组装行为的影响规律,从药剂学角度研究并调控最佳凝胶构成,探索小分子纳米水凝胶承载中药的作用机制,通过对新制剂开展质量标准研究、药剂学评价、药效学评价等药学研究,为蜂胶小分子纳米水凝胶的临床应用及治疗口腔溃疡中药的新剂型的研究提供科学依据。方法:1.小分子纳米水凝胶基质的构建及性能研究(1)采用溶胶-凝胶法,将一定质量的核黄素(A)和三嗪环衍生物(B)制备了不同配比共混物AB,研究了 AB共混物的凝胶行为,证明适当比例的复合物在水中形成稳定的凝胶,利用红外光谱IR、WAXD等手段推测了复合物可能的键合方式及超分子自组织模式。(2)通过测定凝胶基质临界浓度判定其成凝胶能力。(3)在扫描电子显微镜下观察其微观形貌研究微观下的聚集行为。(4)以红外光谱、核磁共振光谱、X-射线衍射手段研究分子间作用原理。(5)考察凝胶基质的凝胶-溶胶转变温度、测定pH值及不同pH值溶液对其影响,研究凝胶基质性能。结果:(1)A与B分别以摩尔比率配比1:1,1:2,2:1,3:1,4:1在水溶剂中形成稳定的黄色不透明凝胶,分别以AB11,AB12,AB21,AB31,AB41记录。(2)临界浓度:AB11(c=0.12mol·L-1)与 AB12(c=0.11mol·L-1)的小分子纳米水凝胶的临界浓度比较大。各比例的凝胶均具有热可逆性,有较好的稳定性,且在密封后常温放置数天,无变质或结晶现象出现。(3)扫描电子显微镜下AB11干凝胶微观结构由纤维束组成,这些纤维束之间有许多结点相联,形成球状结构;AB12干凝胶微观结构由堆积在一起的长度为2-4μm的纤维组成的薄片状,这样的薄片宽度和长度可达10-20μm,这些数以百计的薄片可堆积更高维度的片状组装聚集体;AB21,AB31,AB41干凝胶都呈现杂乱无章的棒状结构,有3-5μm长度的短棒,也有长度在10-20μm左右的长棒。(4)一定比例的A与B通过分子间氢键作用发生了自组装行为。(5)凝胶-溶胶转变温度:AB11浓度从0.06 mol·L-1增到0.13mol·L-1时,凝胶-溶胶转变温度从72℃升到98℃。AB12的浓度从0.06 mol·L-1增加到0.12 mol·L-1时,凝胶-溶胶转变温度从90℃升到98℃。AB11,AB 12,AB21,AB31,AB41 的 pH 值分别为 6.73,6.92,7.05,7.35,7.33,不同 pH值溶液对AB小分子纳米水凝胶的影响:AB小分子凝胶在pH值为2、4、6、7、8、10、12的溶液中都较稳定。小结:核黄素和三嗪环衍生物可以通过分子间氢键作用自组装形成小分子纳米水凝胶,AB11、AB12可以选作载药基质,其热稳定性好,对酸碱溶液不敏感,自身pH值在6.7-7.0。2.小分子纳米水凝胶承载蜂胶提取物超微粉末的性能研究方法:(1)采用溶胶-凝胶法制备蜂胶小分子纳米水凝胶,经过载药能力实验,确定最佳载药凝胶及其最大载药量。(2)扫描电子显微镜下观察凝胶基质载药前后真空冻干粉的微观形貌探究微观结构变化。(3)经热稳定性试验、耐寒试验、耐热试验、光照试验、测定pH值及pH使用范围研究蜂胶小分子纳米水凝胶的性能。结果:(1)AB11的最大载药量为0.3mg(c=0.12 mol·L-1),AB12的最大载药量可达到 0.45 mg(c=0.11 mol·L-1)。(2)AB11载药后SEM图中有单小球体,有20μm左右的棒,有的棒还嵌查在网结构里,大部分的形貌是有孔的网状结构,有与未载药图中相近的相连球状;AB12未载药SEM图中薄片的面积很大,载药后片与片堆积在一起,形成厚厚的片状,有的片与片重叠形成了花瓣状,这些花瓣状的结构是由一系列的直径为5-10μ m卷曲的薄片构成。(3)热稳定性:蜂胶小分子纳米水凝胶与凝胶基质变成溶液流下来时温度分别在90-98 ℃、80-98℃之间。pH 值:6.7-7.0。pH使用范围:在pH7～8的溶液中较稳定。耐寒试验:-19℃,24h取出时外观发生裂痕,3℃,24h取出时,外观没有变化。耐热实验:55℃的横温箱中24h取出后,凝胶基质及蜂胶小分子纳米水凝胶外观均未发生变化。光照实验:5 0 0 0 ± 4 5 0 1 x的条件下 2 4 h取出后,凝胶基质及蜂胶小分子纳米水凝胶外观均未发生变化。小结:AB12为最佳凝胶基质,对蜂胶的最大承载量可达到0.45 mg(c=0.11 mol·L-1)。凝胶基质承载蜂胶后凝胶结构更加稳定;蜂胶小分子纳米水凝胶的pH值在6.7-7.0之间,在pH7～8的溶液中均较稳定,在0℃—55 ℃条件下稳定,对光稳定。3.蜂胶小分子纳米水凝胶制剂的药学研究3.1蜂胶小分子纳米水凝胶的质量标准研究方法:(1)分别采用薄层色谱法、紫外分光光度法对凝胶中的蜂胶进行鉴别与含量测定;(2)依照《中国药典》2010年版一部附录IQ项下凝胶剂的有关规定,按201 0版《中国药典》一部附录ⅦG方法测定蜂胶小分子纳米水凝胶的pH值、依照《中国药典》2010年版一部附录XII I C检查微生物限度、依照《中国药典》2010年版一部附录IXE金属检查法第二法检查重金属、依照《中国药典》2010年版一部附录IX F砷盐检查法第一法检查砷盐。结果与小结:(1)采用三氯甲烷-甲醇-丁酮(9.4:0.3:0.3)为展开剂,以三氯化铝试液为显色剂,紫外灯(365nm)下薄层色谱检测蜂胶。紫外分光光度法测得凝胶中蜂胶总黄酮以芦丁(C17H3C0O16)计不得少于30.0%。(2)各项检查均符合《中国药典》2010年版一部附录I Q项下凝胶剂的各项规定:三个批次供试品的pH分别为6.9,7.2,7.1,重金属限度检查与重砷盐限度检查结果均未结果均未超过百万分之十,微生物限度检测中细菌总数在289-3 11个/g、霉菌(酵母菌)总数均〈10/g、未检测出铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌、活螨等。3.2蜂胶小分子纳米水凝胶的药剂学评价方法:采用黏度计测定凝胶黏度,采用位移法测定其黏附力,采用小池扩散法考察凝胶的黏膜渗透性,采用体外溶出法考察其体外释药行为。结果与小结:蜂胶小分子纳米水凝胶的黏度、黏附力、黏膜渗透性及其体外释放度均符合2010年版《中国药典》中的相关规定。3.3蜂胶小分子纳米水凝胶的药效学评价及机制研究方法:(1)采用打孔法测定蜂胶小分子纳米水凝胶对7个菌种的抑菌率,研究凝胶剂的抑菌作用。(2)制备改良的彭氏家兔口腔溃疡模型,以桂林西瓜霜为阳性对照药,每日观察用药后家兔模型溃疡直径变化、记录溃疡愈合时间,光镜下对溃疡区标本做病理组织学检查。(3)通过蜂胶小分子纳米水凝胶对二甲苯致小鼠耳肿胀作用、对鸡蛋清致大鼠足肿胀影响两个实验,研究其抗炎作用。(4)采用改良的彭氏家兔口腔溃疡模型,于试验结束后测定试验家兔血清中IL-6和TNF-α水平。结果:(1)测得对各个菌种的抑菌率:金黄色葡萄球菌89%肠球菌92%大肠杆菌88%绿脓杆菌90%变形杆菌88%表皮葡萄球菌88%沙门氏菌87%。(2)蜂胶组口腔溃疡家兔模型经蜂胶小分子纳米水凝胶治疗,治疗4d后和治疗8d后的口腔溃疡直径均明显小于空白组,经比较,P<0.001;其对溃疡直径的缩小效果与西瓜霜组比较,P>0.05,无明显差异性;蜂胶组口腔溃疡的平均愈合时间为(9.5±1.29)d,明显小于空白组,经比较,P<0.05;其平均愈合时间与西瓜霜组比较,P>0.05,无明显差异性。光镜下观察可见,用药4d后,各组炎症反应明显减轻,但空白组仍可见表皮组织形成溃疡,且组织缺乏,肌肉间急性炎细胞浸润,部分组织坏死。蜂胶组仍可见表皮组织有溃疡灶,溃疡内炎细胞浸润数量比较之前明显减少。西瓜霜组仍可见组织坏死及脓肿。用药8d后,空白组可见肌间的炎症细胞数量减少,但肌肉组织仍有水肿存在。蜂胶组用药8d后,除少量组织内可见炎细胞浸润,纤维细胞增生,周围有部分胶原纤维,溃疡表面基本趋于愈合。(3)蜂胶小分子纳米水凝胶对鸡蛋清致大鼠足肿胀、对二甲苯致小鼠耳肿胀均有明显的抑制作用。(4)蜂胶组与西瓜霜组IL-6及TNF-α均显著低于空白组,组间差异均具有有统计学意义(P<0.001)。小结:(1)蜂胶小分子纳米水凝胶具有抑菌作用,其抑菌效果与自身浓度有关,与阳性对照桂林西瓜霜和单纯蜂胶溶液相当,对金黄色葡萄球菌的抑制效果最强(P<0.05)。(2)蜂胶小分子纳米水凝胶对改良的彭氏家兔口腔溃疡模型具有显著的治疗作用,与桂林西瓜霜的治疗效果相当。(3)抗炎试验证明本品具有一定的抗炎作用。(4)蜂胶小分子凝胶制剂可能通过降低外周血中IL-6及TNF-α等炎性细胞因子水平来促进溃疡的愈合。3.4蜂胶小分子纳米水凝胶的初步稳定性考察方法:对蜂胶小分子凝胶进行光加速、高温、低温、冷冻、离心影响因素试验,并对3批样品进行3个月的初步稳定性考察。结果:影响因素试验结果表明蜂胶小分子纳米水凝胶剂在4-55℃、相对湿度85%± 5%、5000± 450 1 x光照、离心条件下均较稳定,物理形态与有效成分含量都不会发生变化;0℃以下冷冻条件下凝胶剂变为固体,有断裂现象。提示该制剂常温下保存即可。初步稳定性试验表明,3批次制剂在室温20℃、避光、湿度75%条件下保存3个月,性状与含量均无明显变化。小结:蜂胶小分子纳米水凝胶在0℃以上的室温、干燥、避光的条件保存。