论文部分内容阅读
涎腺腺样囊性癌(Salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)是一种较为常见的涎腺恶性肿瘤，约占所有涎腺肿瘤的10％及涎腺恶性肿瘤的30％。SACC生长缓慢，但由于侵袭性较强，容易发生神经和血管的侵袭，且复发和远处转移是治疗失败的主要原因，其10年生存率普遍较低。因此，对SACC转移机制的研究是亟待解决的临床和基础的重大医学问题，意义深远。 MicroRNA(miR)是一类长度为19-25nt的单链非编码RNA，平均长度22 nt，其主要通过与编码蛋白靶mRNA的3非编码区结合，影响mRNA的稳定性，导致其降解，或是抑制mRNA的翻译，进而对基因进行转录后的调控。业已证实miR-21是一个癌基因，在多种肿瘤中显著上调，并通过多种机制调控一些重要靶基因，参与细胞增殖、分化、凋亡等过程，与肿瘤生长、侵袭、转移、耐药等密切相关。抑癌基因PDCD4是miR-21重要的靶基因之一，目前已有研究表明miR-21在肾癌中通过降低PDCD4表达水平来促进肿瘤的转移，然而miR-21在SACC细胞的表达水平、发挥的作用及其所通过的信号途径仍鲜见文献报道。 本研究拟从涎腺腺样囊性癌组织和细胞株两个层面入手，分三个部分实验逐步探讨并验证miR-21在涎腺腺样囊性癌中的表达情况、发挥的作用及分子机制。 第一部分 miR-21在涎腺腺样囊性癌细胞中的表达丰度及临床意义 目的: 研究miR-21在涎腺腺样囊性癌细胞中表达和意义，分析miR-21高表达的临床病理意义，及对患者预后的影响。 方法: 采用实时荧光定量PCR检测miR-21在涎腺腺样囊性癌组织、癌旁正常组织及人涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-LM和SACC-83中的表达情况，并分析miR-21表达水平与涎腺腺样囊性癌临床病理特征之间的关系。 结果: 1.与癌旁正常组织相比较，miR-21在涎腺腺样囊性癌组织、SACC-LM和SACC-83细胞株中都存在高表达(P＜0.05)，且具有高转移的能力的SACC-LM细胞株中miR-21的表达量明显高于低转移能力的SACC-83细胞株(P=0.001)。 2.miR-21的表达水平与涎腺腺样囊性癌患者的复发/转移密切相关(P＜0.05)，而与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤组织类型、神经侵犯、骨组织侵犯、淋巴结转移及T分期等均无关（均P＞0.05）。 3.miR-21高表达与患者的预后显著相关，miR-21上调组（≥2倍）患者的无病生存期明显低于正常组（＜2倍），其无病中位生存期分别为28月和64月(P=0.005)。 结论: miR-21在SACC组织中表达上调，其表达水平与复发/转移密切相关，而与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤组织类型、神经侵犯、骨组织侵犯、淋巴结转移及T分期等均无关。miR-21在SACC细胞株也存在表达上调，SACC-LM细胞中miR-21的表达明显高于SACC-83细胞。提示miR-21可能介导SACC细胞的转移能力，其高水平表达与SACC患者的预后密切相关，有望成为SACC患者预后评估的新的生物标记物。 第二部分 STAT3-miR-21-PDCD4环路介导涎腺腺样囊性癌细胞侵袭与转移的功能 目的: 研究miR-21表达对SACC细胞侵袭和转移能力的影响及其分子机制。探讨miR-21、STAT3、PDCD4三者之间的相互关系，及STAT3-miR-21-PDCD4环路对SACC细胞侵袭和转移的影响。 方法: 1.利用transwell侵袭实验来检测，miR-21 inhibitor抑制miR-21表达或pre-miR-21上调miR-21表达对SACC细胞侵袭能力的影响。 2.利用划痕愈合实验来检测，miR-21 inhibitor抑制miR-21表达或pre-miR-21上调miR-2i表达对SACC细胞转移能力的影响。 3.通过生物信息学预测miR-21的靶基因，合成pGL3-PDCD4-wt和pGL3-PDCD4-mut质粒，并通过双荧光素霉报告系统来验证PDCD4是否为miR-21的直接靶基因。 4.向SACC-LM细胞中转入miR-21 inhibitor及相应的空白质粒，提取实验组、对照组(NC)及空白培养基组(MOCK)细胞的总RNA和蛋白，利用实时荧光定量PCR检测其中miR-21和PDCD4 mRNA的表达水平，利用Western blot来检测PDCD4和pSTAT3蛋白的表达水平。 5.向SACC-LM细胞中转入shRNA-pSTAT3及相应的空白质粒，提取实验组、对照组(NC)及空白培养基组(MOCK)细胞的总RNA和蛋白，利用实时荧光定量PCR检测其中miR-21的表达水平，利用Western blot来检测pSTAT3和PDCD4蛋白的表达水平。 结果: 1.transwell侵袭实验:①miR-21 inhibitor组，34±12cell/HP:空白对照组，141±21cell/HP。②pre-miR-21组，174±22cell/HP:空白对照组，116±18cell/HP。 2.划痕愈合实验:①miR-21 inhibitor组，23±5cell/HP:空白对照组，58±8cell/HP。②pre-miR-21组，72±11cell/HP:空白对照组，43±7cell/HP。 3.①导入pGL3-PDCD4-wt的细胞中，加入miR-21 inhibitor的实验组细胞荧光素活性明显高于NC对照组(P＜0.05)。②导入pGL3-PDCD4-mut的SACC-LM细胞中，加入miR-21 inhibitor的实验组和NC对照组的荧光酶素活性无明显差异 4.①RT-PCR结果显示，在转入了miR-21 inhibitor的实验组的SACC细胞中miR-21的表达水平较NC组和空白培养基组(MOCK)(P＜0.05)，PDCD4的mRNA水平在三组之间并无明显差异(P＞0.05)。②Western Blot结果显示:miR-21inhibitor组细胞中PDCD4蛋白的表达量较NC组和MOCK组明显升高(P＜0.05)，而miR-21 inhibitor组细胞中pSTAT3蛋白的表达水平却较NC组合MOCK组明显降低(P＜0.05) 5.①RT-PCR结果显示shRNA-pSTAT3组细胞中miR-21表达量明显低于NC组和MOCK组(P＜0.05)。②Western Blot结果显示shRNA-pSTAT3组细胞中pSTAT3表达水平明显低于NC组和MOCK组(P＜0.05)，而PDCD4蛋白水平却明显高于NC组合MOCK组(P＜0.05) 结论: 1.在体外SACC细胞实验中，抑制miR-21表达能有效抑制SACC细胞的侵袭和转移能力;而上调miR-21的表达则能显著促进SACC细胞的侵袭和转移能力。 2.PDCD4是miR-21的直接靶基因，且SACC细胞中miR-21主要通过转录后途经调控PDCD4的表达。 3.在体外SACC细胞实验中，抑制miR21的表达能有效上调PDCD4蛋白的表达，进而抑制pSTAT3蛋白的表达，从而有效抑制SACC-LM细胞的侵袭和转移能力。 4.在体外SACC细胞实验中，抑制pSTAT3的表达能有效下调miR-21的表达，进而上调PDCD4蛋白的表达，从而有效抑制SACC-LM细胞的侵袭和转移能力。 第三部分涎腺腺样囊性癌组织中PDCD4和STAT3蛋白的表达情况及其相关性分析 目的: 研究PDCD4和pSTAT3在涎腺腺样囊性癌组织和细胞株中的表达情况及相关性。 方法: 1.甲醛固定，石蜡包埋肿瘤组织，切片，采用免疫组化方法检测35例肿瘤样本中各自PDCD4及pSTAT3蛋白的表达情况，采用Pearson相关性分析法分析miR-21、PDCD4、pSTAT3之间的相关性。 2.随机选取4对有癌旁配对的肿瘤和癌旁正常组织，破碎组织，提取蛋白，采用Western Blot检测组织中PDCD4、STAT3、pSTAT3的表达水平。 结果: 1)①miR-21表达水平与PDCD4蛋白水平呈负相关(Pearson correlation，r=-0.556, P=0.001)。 ②miR-21表达水平与pSTAT3蛋白水平呈正相关(Pearson correlation，r=0.661, P=0.000)。 ③PDCD4蛋白的表达水平与PSTAT3蛋白表达水平呈负相关(Pearsoncorrelation, r=-0.972, P=0.000)。 2)癌旁组织中PDCD4蛋白的表达量明显高于肿瘤组织;而STAT3及pSTAT3蛋白的表达量则低于肿瘤组织，且蛋白的表达量与miR-21的表达量也表现出一定的相关性。 结论: 在SACC肿瘤组织中，miR-21表达水平与PDCD4蛋白水平呈负相关，与pSTAT3蛋白水平呈正相关。PDCD4蛋白的表达水平与pSTAT3蛋白表达水平呈负相关。这进一步从组织层面上证实了miR-21、PDCD4、pSTAT3三者之间的相互关系。