论文部分内容阅读
目的交感神经激活与慢性肾脏病（CKD）进展有关,慢性衰老细胞在老化和损伤的肾脏中积累,导致肾损伤后进行性纤维化。本研究主要探讨肾脏交感神经调控细胞衰老在肾脏纤维化中的作用及机制,为探索防治慢性肾脏病的新治疗靶点提供理论依据。方法首先我们建立了肾脏去神经动物模型,并在去神经成功2天后构建单侧输尿管梗阻（UUO）和单侧肾脏缺血再灌注损伤（UIRI）小鼠模型,以探讨肾交感神经与CKD以及与肾脏衰老的关系。其次,我们使用交感神经递质去甲肾上腺素（NE）在体外刺激肾小管上皮细胞,观察其衰老相关蛋白和衰老相关分泌表型的变化,进一步探讨交感神经能否调控细胞衰老。此外,我们使用各种选择性肾上腺素能受体（AR）拮抗剂和si RNA预处理肾小管上皮细胞,以探讨交感神经调控细胞衰老的具体机制。结果在UUO和UIRI小鼠模型中,肾脏间质纤维化和衰老加重,阻断肾交感神经延缓肾间质纤维化的同时改善肾脏衰老。在体外实验中,交感神经递质NE促进肾小管上皮细胞衰老,并上调促纤维化生长因子水平。进一步的研究结果显示,α2-肾上腺素能受体（α2-AR）介导交感神经调控肾小管上皮细胞衰老,且其主要受体亚型为α2A-AR。此外,β-arrestin 2蛋白作为α2A-AR的下游靶点,通过线粒体损伤和NF-κB通路促进交感神经调控肾小管上皮细胞衰老。结论交感神经递质NE通过α2A-AR/β-arrestin 2/线粒体损伤以及NF-κB通路促进肾小管上皮细胞衰老,驱动肾脏纤维化发生发展。第一部分:交感神经激活促进肾小管上皮细胞衰老,驱动肾间质纤维化发生发展目的本部分内容主要探讨了交感神经激活和细胞衰老在肾脏间质纤维化中的作用,以及交感神经激活在细胞衰老过程中发挥的效应,阐述了交感神经、细胞衰老和肾脏间质纤维化三者之间的联系,为从神经调控和细胞衰老的角度防治肾间质纤维化提供实验支持。方法首先,我们成功建立肾脏去神经动物模型2天后,再构建单侧输尿管梗阻（UUO）和单侧肾脏缺血再灌注损伤（UIRI）小鼠模型,以探讨肾交感神经与肾小管间质纤维化以及与肾脏衰老的关系。其次,在体外实验中,我们使用交感神经递质去甲肾上腺素（NE）模拟交感神经激活状态来刺激肾小管上皮细胞,并以H2O2刺激作为阳性对照,进一步探讨交感神经与细胞衰老的关系。结果在UUO和UIRI小鼠模型中,肾脏间质纤维化和衰老加重,阻断肾交感神经延缓肾间质纤维化的同时改善肾脏衰老。在体外实验中,交感神经递质NE促进肾小管上皮细胞衰老,并上调促纤维化生长因子水平。结论交感神经激活促进肾小管上皮细胞衰老,释放衰老相关分泌表型（SASP）增加,通过旁分泌作用招募炎症细胞,增加炎症,且上调促纤维化生长因子和基质合成分子,促进肾脏间质纤维化的发生发展。第二部分:α2-肾上腺素能受体（α2-AR）介导交感神经调控肾小管上皮细胞衰老,其主要受体亚型是α2A-AR目的本部分内容主要为了明确交感神经激活后,交感神经递质去甲肾上腺素（NE）通过哪一种具体的肾上腺素能受体（AR）进行信号转导,进而调控肾小管上皮细胞衰老,为挖掘交感神经调控细胞衰老这一现象背后的机制提供实验证据。方法首先,在体外实验中,我们使用交感神经递质去甲肾上腺素（NE）刺激肾小管上皮细胞,检测各个AR的表达情况。然后在此基础上使用几种选择性AR拮抗剂（如β2-AR拮抗剂Butoxamine和ICI118551、α2-AR拮抗剂Atipamezole、α2A-AR拮抗剂BRL44408、α2B-AR拮抗剂Imiloxan以及α2C-AR拮抗剂JP1302）分别在不同浓度下预处理肾小管上皮细胞,以探讨交感神经调控细胞衰老的下游途径。结果五种AR在肾小管上皮细胞中均有表达,但表达量最高的为α2-AR和β2-AR。与Control组相比,NE刺激后衰老相关蛋白和衰老相关分泌表型表达增加,而与NE刺激组相比,只有α2-AR拮抗剂Atipamezole预处理组和α2A-AR拮抗剂BRL44408预处理组的细胞衰老情况被逆转,而Butoxamine和ICI118551（β2-AR拮抗剂）、Imiloxan（α2B-AR拮抗剂）以及JP1302（α2C-AR拮抗剂）预处理后均没有改善NE促进肾小管上皮细胞衰老的情况。结论α2-肾上腺素能受体（α2-AR）介导交感神经调控肾小管上皮细胞衰老,且其主要受体亚型为α2A-AR。第三部分:β-arrestin 2蛋白作为α2A-AR的下游靶点,通过线粒体损伤和NF-κB信号通路促进交感神经调控肾小管上皮细胞衰老目的本部分内容探讨了交感神经激活,交感神经递质去甲肾上腺素（NE）作用于α2A-AR后,其下游机制是什么,从更深层次阐明交感神经调控细胞衰老潜在的机制,也为线粒体功能障碍在CKD进展中的作用提供更全面的实验证据。方法首先,我们设计了3条si RNA（si-Arrb2-1、si-Arrb2-2、si-Arrb2-3）来特异性下调TKPTS细胞中的β-arrestin 2基因。随后,我们在体外成功下调β-arrestin 2后给予NE刺激48h,以探讨β-arrestin 2在NE促进肾小管上皮细胞衰老中的作用。此外,我们也通过细胞免疫荧光共染和免疫共沉淀来研究α2A-AR与β-arrestin 2之间的联系。最后,我们在si RNA预处理肾小管上皮细胞后观察线粒体相关指标和NF-κB的变化情况,以探讨β-arrestin 2的下游机制。结果NE刺激后β-arrestin 2表达增加,敲低β-arrestin 2可以改善NE所致的肾小管上皮细胞衰老,且α2A-AR与β-arrestin 2存在共表达。敲低β-arrestin 2可以逆转NE造成的线粒体损伤,也可以逆转NE诱导的NF-κB表达上升。结论β-arrestin 2蛋白作为α2A-AR的下游靶点,通过线粒体损伤和NF-κB信号通路促进交感神经调控肾小管上皮细胞衰老。