【摘 要】
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贾第虫病(Giardiasis)是由寄生于十二指肠的贾第虫(Giardia spp.)引起的以腹泻为主要症状的人兽共患原虫病。宿主感染贾第虫后因自身免疫能力的差异表现出不同症状。其中免疫
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贾第虫病(Giardiasis)是由寄生于十二指肠的贾第虫(Giardia spp.)引起的以腹泻为主要症状的人兽共患原虫病。宿主感染贾第虫后因自身免疫能力的差异表现出不同症状。其中免疫正常的宿主多产生自限性腹泻,而免疫力低下的宿主尤其艾滋病患者则产生脱水性腹泻,严重者危及生命。该病呈世界性分布,感染性极强,宿主仅摄入10个左右的感染性包囊即可引发感染,因此贾第虫也被WHO列为首要容易忽视的病原体。贾第虫是较为古老的低等真核生物,其具有独特的细胞内超微结构(如存在外周囊泡和缺乏线粒体、典型的高尔基体及过氧化物酶类等),然而在增殖方面,贾第虫却仍然保留着原核生物的二分裂方式,生活史较为简单,仅分为滋养体和包囊两个阶段,使其成为研究高等真核生物细胞或其它寄生虫细胞分化和分子机理的重要模式生物。研究贾第虫的分子机理需对其进行基因操作,对贾第虫的基因组进行编辑有利于我们了解各基因的功能,为阐明该病原的致病机理和毒力因素提供理论基础,同时也为研究治疗贾第虫病提供新的药物靶点。近年来,CRISPR-CAS9基因编辑系统被发现并在生命科学各领域得以广泛应用,其快速有效的靶基因编辑体系是以CAS9蛋白为功能核心,包含靶基因序列的CRISPR片段为激活器协同实现目的基因的敲除或敲入的。因其仅需将上述两组分构建成质粒,转染至细胞内便可通过药物筛选出稳定的基因编辑后的细胞系,相比传统的基因编辑手段,具有成本低和操作简单等优点。本研究以弓形虫CRISPR-CAS9基因编辑载体为参照,该载体已成功应用于弓形虫的基因敲除,详细分析该载体的各组成元件,以pBluescript质粒为载体骨架,GDH、Actin、α-giardin、δ-giardin和CWP1基因的5’端UTR为内源启动子(含CA_nT框和A/T盒等关键基因启动序列),TUB基因的3’端UTR(含polyA尾)为转录剪切信号,分别构建了五种贾第虫CAS9基因的真核转染载体。通过电转染方式将载体转染至贾第虫滋养体细胞内,培养24 h后收集滋养体于荧光显微镜下观察,筛选有效的贾第虫内源启动子,同时结合间接免疫荧光技术以及Western blot实验分析CAS9蛋白在贾第虫滋养体内的表达情况。结果显示,构建的五种贾第虫内源启动子CAS9真核转染载体仅GDH启动子能够表达CAS9蛋白,将滋养体涂片后置于荧光显微镜下观察EGFP-CAS9融合蛋白呈绿色,间接免疫荧光实验进一步确定CAS9蛋白的表达并广泛分布于滋养体细胞质内。Western blot结果显示蛋白大小约189 kDa,其结果与预测值相符。本研究构建的贾第虫CAS9基因表达载体为瞬时表达载体,为评价在GDH启动子的启动下该载体在滋养体内的停留周期,将电转染后的贾第虫滋养体以不同的培养时间梯度分组,用“冰浴法”收集各组滋养体,提取总RNA并反转录成cDNA,以cDNA为模板进行qPCR检测CAS9基因在不同时间组的相对表达量,同时设置β-antin基因为内参,通过△CT法评价CAS9基因转录的趋势。结果显示,CAS9基因表达载体在转染2 d后其基因转录水平达到最高,5 d后趋于零,说明该载体能够在滋养体细胞内停留5 d左右。本研究为贾第虫内源启动子表达CAS9蛋白提供了理论依据,同时在新型贾第虫基因编辑工具的建立方面具有积极意义。
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