海洋病原菌监测基因芯片的研制及功能验证

来源 :南开大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cuicuiCUICUI123
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目前,寡核苷酸微阵列应用于多种微生物的检测,将多种特异性的寡核苷酸探针固定在完成包被的玻片上,将样本进行DNA扩增,并与该玻片杂交,该检测方法能检测出多种病原体,并且检测结果具有很高灵敏度和特异性,能进行高通量的检测。   微阵列检测的特异性主要依赖于基因靶序列的选取及微阵列探针的设计。大部分微阵列使用16S rRNAs作为靶序列用于区分不同的微生物。但是一些关系较近的细菌中,16S rRNAs序列相似度较高,因此使用16S rRNAs不易对这些菌进行区分。   定位在大多数rRNA操纵子16S-23S rRNA基因间的ITS(转录间隔序列),比毗连的16S rRNA,23Sr RNA基因在长度和序列上更具多样性,甚至同一菌种的ITS或同一菌株的不同操纵子的ITS也存在变异。一般而言,这一区域由一系列保守的DNA片段和高变异的DNA片段组成,其中,保守片段在某特定种的所有株中都能找到,但在属或科水平却很少存在这样的片段;高变异片段的变异形式有插入,缺失,序列高变异等形式。该保守区域可用于在种水平进行精确的鉴定。由于ITS两侧分别是16S rRNA和23S rRNA保守基因,因此,ITS的PCR扩增可使用位于保守区的通用引物,更加简单方便扩增到靶DNA序列。   本研究使用DNA微阵列检测技术,针对多种致病菌的16S-23S rRNA基因转录间区序列(ITS),设计特异基因探针,并整合成一个检测这些病原菌的探针微阵列固定于玻璃基质上,用于检测霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、单核增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和沙门氏菌(Salmonella spp.)。   本研究方法使用过滤富集海水中菌体,因此不需培养增菌,能够检出不能人工培养的苛性菌,提高了检测的可靠性。结果表明这一DNA微阵列检测方法能够方便快速地给出丰富的指标菌污染信息,适合于海水致病菌污染检测。
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