论文部分内容阅读
邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(Di(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)是广泛用于食品包装、化妆品、儿童玩具及医疗制品等产品的一种增塑剂。由于DEHP不以共价键形式而是物理结合于聚氯乙烯分子上,因而极易逸散到空气、水和土壤等环境介质。苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene, BaP)是环境中有机物的不完全燃烧及热分解过程的产物,在自然界中很难降解。环境监测数据显示,DEHP和BaP普遍共存于各种环境介质中。人体可以通过消化道、呼吸道和皮肤接触等途径暴露于此两种环境污染物。 研究表明,DEHP可引起生殖发育毒性等,近年研究又报道了DEHP的肝脏毒性。BaP作为最早被发现的环境化学致癌物,同样具有肝脏毒性。前期研究多报道DEHP和BaP单独的肝脏毒性,但关于两者联合暴露对生物体的肝脏毒性作用鲜有报道。由于环境污染物对人体的健康效应是多种污染物长期共同作用的结果,因此,DEHP与BaP共同作用而引起的不良健康效应不容忽视。 外源化合物进入机体后,需在相关代谢酶的作用下进行代谢。其中细胞色素P450酶系(Cytochrome P450 enzymes, CYP450s)是广泛存在于生物体肝脏的Ⅰ相反应代谢酶。BaP进入机体后需经细胞色素P450酶系中CYP1A1酶代谢活化, DEHP进入机体后可通过孕烷X受体途径被CYP3A4酶代谢。乙氧基异吩恶唑酮-O-脱乙氧基酶(EROD, Ethoxyresorufin-O-deethylase)和7-乙氧香豆素-O-脱乙基酶(ECOD,7-ethoxycoumarin-O-deethylase)实验已被广泛用于评价 CYP1A1和CYP3A4酶类活性。 细胞凋亡是细胞主动死亡的过程,包括内源性和外源性两种形式,其中线粒体途径是细胞内源性凋亡的重要途径之一。在受到外界环境因素刺激时,细胞内的活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)水平发生改变,线粒体内氧化还原稳态的平衡遭到破坏,导致线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)下降,并最终使细胞进入不可逆的凋亡过程。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2可通过形成同源或异源二聚体影响线粒体途径诱导细胞凋亡的调控机制。 已知许多环境污染物可致细胞凋亡。但是,有关环境污染物联合作用对线粒体介导的细胞凋亡的调控机制研究仍有限。鉴于此,本研究选取了人张氏肝细胞(Chang liver)为靶细胞,以DEHP和BaP为受试物,评价DEHP和BaP联合染毒对人张氏肝细胞活力,EROD和ECOD酶活性、ROS生成、线粒体膜电位以及凋亡相关蛋白 Bax和Bcl-2蛋白表达水平的影响,为进一步研究线粒体途径在DEHP和BaP致细胞凋亡中的调控作用提供一定的科学线索。本研究分为两部分: 第一部分 DEHP和BaP联合染毒对人张氏肝细胞活力、EROD和ECOD酶活性的影响 目的:评价DEHP与BaP联合染毒对Chang liver细胞活力、EROD和ECOD酶活性的影响。 方法:用设定浓度的DEHP(62.5μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)与BaP(64μmol/L)单独或联合染毒Chang liver细胞24h和48h。用CCK-8法检测细胞活力,用化学荧光法检测EROD和ECOD酶活性。 结果:较高浓度DEHP单独染毒组(250μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)和所有DEHP与BaP的联合染毒组细胞活力降低(P<0.05或P<0.01)。在DEHP单独染毒组未观察到 EROD酶活性的变化,在24h观察点,较高浓度DEHP(250μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)单独染毒组ECOD酶活性升高,而上述浓度DEHP与BaP(64μmol/L)联合染毒组的EROD和ECOD酶活性均显著性升高。在48h观察时点,125μmol/L及以上的DEHP单独染毒组ECOD酶活性升高,联合染毒各组的EROD和ECOD酶活性则均呈显著性升高(P<0.05或P<0.01)。 结论: DEHP与BaP联合染毒引起Chang liver细胞活力降低;DEHP单独染毒Chang liver细胞诱导ECOD酶活性升高(P<0.05或P<0.01);DEHP与BaP联合染毒则诱导了EROD和ECOD酶活性均显著性升高(P<0.01)。 第二部分DEHP和BaP联合染毒人张氏肝细胞对线粒体介导凋亡的影响 目的:重点研究DEHP与BaP联合染毒人张氏肝细胞对线粒体介导的凋亡的影响。 方法:用设定浓度的DEHP(62.5μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)与BaP(64μmol/L)单独或联合染毒Chang liver细胞24h和48h。2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐染色检测细胞内ROS含量。罗丹明123染色检测线粒体膜电位。流式细胞仪检测细胞的凋亡率。用实时定量 PCR法检测凋亡相关基因bax, bcl-2和caspase-3的表达水平。用Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达量。 结果: DEHP与BaP联合染毒诱导了靶细胞内ROS水平明显升高,且均高于相应的DEHP单独染毒组(P<0.05或P<0.01)。与相应浓度的DEHP单独染毒组比,较高浓度DEHP(250μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)与64μmol/L BaP联合染毒靶细胞24h,引起了线粒体膜电位降低和细胞凋亡率的升高(P<0.01)。此外,还检出活化Caspase-3的高表达,bax/bcl-2和Bax/Bcl-2比值的升高;在48h观察点,≥125μmol/L的DEHP与64μmol/L Bap联合染毒组亦呈现相同变化趋势。 结论:一定浓度的DEHP(125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)与64μmol/L的BaP联合染毒Chang liver细胞,促发ROS水平升高和线粒体膜电位的降低,并导致细胞凋亡;凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和活化的Caspase-3参与了此调控过程。