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目的： 通过动物实验研究，探讨温阳补肾方对激素性股骨头坏死组织VEGF及RANKL/RANK/OPG通路表达的影响，从分子水平探讨温阳补肾方治疗激素性股骨头坏死的作用机制，为温阳补肾方的治则治法提供实验依据。 方法： 1、兔激素性股骨头坏死模型的建立 1.1造模:用改进的马血清联合甲强龙的方法，新西兰大白兔精确称重，按10 mL·kg-1的剂量经兔耳缘静脉注射马血清。间隔3周，按6mL·kg-1的剂量再次注射马血清。间隔2周后，按45 mg·kg-1的剂量腹腔注射甲基强的松龙，连续3天，每天一次。注射激素期间，每天每只大白兔腹腔注射青霉素10万单位，连续7天，预防感染。 1.2动物模型鉴定:运用空气栓塞法处死，常规HE染色，光镜下观察股骨近端骨组织和骨髓组织的骨小梁、骨髓造血组织、成骨细胞、骨细胞、脂肪细胞的病理改变。若观察到骨细胞部分核深染，较多的细胞核固缩，核偏位。骨小梁内正常骨细胞数量减少，骨陷窝内骨细胞消失，空骨陷窝数明显增多，提示造模成功。 2、温阳补肾方对兔激素性股骨头坏死股骨头形态学及血清VEGF、RANKL、RANK、OPG含量的影响 2.1动物实验:136只新西兰大白兔随机分为5组:正常组、模型组、中药低(6.44g/kg·d)、中(9.66 g/kg·d)、高(12.88 g/kg·d)剂量组（造模按改进的马血清联合甲强龙的方法）。正常组和模型组每日用生理盐水灌胃10mL。中药治疗组给予不同浓度的温阳补肾方进行灌胃。分别于给药后第4、8、12周取双侧股骨头、血清。 2.2指标检测:股骨头石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下进行骨组织形态计量学指标测定;计算空骨陷窝比率;行电子染色，透射电镜观察股骨头坏死组织中骨细胞超微结构的改变;运用酶联免疫吸附法检测血清VEGF、RANKL、RANK、OPG的含量。 3、温阳补肾方对兔激素性股骨头坏死组织VEGF及RANKL/RANK/OPG通路的影响 3.1动物实验:136只新西兰大白兔随机分为5组:正常组、模型组、中药低(6.44g/kg·d)、中(9.66 g/kg·d)、高(12.88 g/kg·d)剂量组（造模按改进的马血清联合甲强龙的方法）。正常组和模型组每日用生理盐水灌胃10mL。中药治疗组给予不同浓度的温阳补肾方进行灌胃。根据实验二结果，选取给药第8周所取材备用的股骨头。 3.2指标检测:分别提取股骨头组织RNA和蛋白，RT-PCR法检测VEGF及RANKL、RANK、OPG的mRNA表达，Western-Blot法检测目的蛋白的表达。 结果： 1、模型鉴定结果 成功建立了新西兰大白兔SANFH模型。造模后大白兔四肢活动减少，精神状态萎靡，饮食饮水减少，大便减少，毛发光泽暗淡，甚至出现大量掉毛。体重明显下降，皮下脂肪减少。股骨头软骨面颜色偏暗红，表面光泽暗淡，触摸略微粗糙，且骨质较脆，截取容易。股骨头石蜡切片HE染色见模型组股骨头软骨层变薄，部分软骨面出现剥脱裂纹。骨小梁结构松散不规则，细长而窄，甚至出现断裂。软骨细胞和骨细胞减少，且骨细胞肿大，出现较多的空骨陷窝，髓腔可见大量肥大的脂肪细胞，骨髓细胞减少，造模成功。 2、股骨头石蜡切片HE染色观察 温阳补肾方可改善SANFH股骨头病理变化。模型组股骨头软骨层变薄，部分软骨面出现剥脱裂纹。骨小梁结构松散不规则，细长而窄，甚至出现断裂。软骨细胞和骨细胞减少，且骨细胞肿大，出现较多的空骨陷窝，髓腔可见大量肥大的脂肪细胞，骨髓细胞减少。第4、8、12周时，中药低、中、高剂量组空骨陷窝率均明显低于模型组。从各时间点显示中药组所用药物剂量与空骨陷窝率成反比。各时间点低剂量、中剂量、高剂量中药组之间差异明显。 3、酶联免疫法检测血清VEGF、OPG、RANK、RANKL浓度 温阳补肾方可上调血清OPG含量下调血清RANKL、RANK含量。第4周时，中药中、高剂量组VEGF、RANK、RANKL明显低于模型组，而OPG明显高于模型组。第8周、第12周时，中药低、中、高剂量组VEGF、RANK、RANKL明显低于模型组，而OPG明显高于模型组。以第8周作为变化明显的时间点。 4、股骨头坏死组织中骨细胞超微结构观察 温阳补肾方可改善SANFH坏死组织中骨细胞超微结构的变化。模型组骨细胞核固缩，异染色质聚集甚至核碎裂，多被巨大脂滴压缩到一侧，细胞坏死凋亡形成空骨陷窝，周围的胶原纤维粗大且紊乱。中药低、中、高剂量治疗后细胞结构均有所好转。 5、RT-PCR检测股骨头坏死组织VEGF及RANKL、RANK、OPG的mRNA表达 温阳补肾方可提高VEGF及OPG的mRNA表达，降低RANKL及RANK的mRNA表达。模型组股骨头坏死组织VEGF与OPG的mRNA表达减低，RANK和RANKL的mRNA表达升高。中药各剂量组VEGF与OPG的mRNA表达均升高，RANK和RANKL的mRNA表达均降低，且中、高剂量组比低剂量组升高更明显，中、高剂量组之间无差异。用药剂量与VEGF和OPG mRNA相对表达量呈正比，与RANK和RANKL的mRNA表达呈反比。 6、Western-Blot检测股骨头坏死组织VEGF及RANKL、RANK、OPG蛋白的表达 温阳补肾方可提高VEGF及OPG的蛋白表达，降低RANKL及RANK的蛋白表达。模型组股骨头坏死组织VEGF与OPG的蛋白表达减低，RANK和RANKL的蛋白表达升高。中药各剂量组VEGF与OPG的蛋白表达均升高，RANK和RANKL的蛋白表达量有减低的趋势;且中、高剂量组比低剂量组升高更明显，中、高剂量组之间无差异。用药剂量与VEGF和OPG蛋白相对表达量呈正比，与RANK和RANKL的蛋白表达量呈反比。 7、VEGF与RANKL/RANK/OPG相关性 血液与组织的VEGF与RANKL/RANK/OPG相关性分析均提示:相关性在0.01水平上显著（双尾）。表明血液中与组织中VEGF表达均与OPG表达水平正相关，与RANKL、RANK表达负相关。 结论： 1、温阳补肾方可提高VEGF的表达，从而促进股骨头内血管新生，增强骨组织自身修复能力，发挥治疗激素性骨头坏死作用。 2、温阳补肾方可调节RANK/RANKL/OPG通路的功能，抑制破骨细胞的过度活化，使骨代谢恢复动态平衡，能促进新骨的形成，可能是治疗激素性股骨头坏死的机制之一。 3、血液中与组织中VEGF表达均与OPG表达水平正相关，与RANKL、RANK表达负相关。温阳补肾方治疗SANFH取效的机制之一，可能是通过提高VEGF的表达调控RANKL/RANK/OPG信号通路，使骨代谢恢复动态平衡，刺激新骨的形成来实现的。