论文部分内容阅读
中枢神经系统神经组织的再生是困扰医学界的难题之一，神经干细胞(Neural Stem Cell，NSC)移植治疗是目前一种新兴的，具有良好应用前景的治疗方法，在神经科学领域的许多疾病当中已经有很多研究证实了其移植治疗的有效性。脑外伤是神经外科临床工作中最常见的一大类疾病，危害极大，治疗价值最高。虽然不同种类的脑外伤有各自不同的病理生理过程，但有相当一部分的脑外伤都伴有或轻或重的脑挫裂伤，故本实验就专门针对脑挫裂伤进行研究。NSC依据其来源分为胚胎源性神经干细胞(embryonic-derived neural stem cells，EdNSC)和成体源性神经干细胞(adult derived neural stem cells，AdNSC)两大类。这两类神经干细胞细胞移植治疗脑挫裂伤时哪个效果更好?不同来源的各类神经干细胞移植治疗中枢神经系统损伤时是否发生免疫排斥反应?能否建立一种可控性、重复性好，观察指标明确、操作简单确实可靠的大动物脑挫裂伤模型?对于这些问题，目前尚无系统性的研究。本实验充分利用了克隆羊这一遗传背景清楚的大动物作为模型，同时利用克隆技术得到来源相同的“自体”EdNSC和AdNSC及异体AdNSC，来解决上述问题。本实验的第一部分首先对成体克隆羊(编号：CL-4)及成体非克隆羊(编号：SP-3119)通过开颅手术的方法取得其皮层脑组织，进而在体外培养获得克隆羊及非克隆羊的AdNSC；然后对CL-4克隆羊通过体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技术获得其克隆胚胎羊(此步骤由本课题的合作单位完成)，当胚胎羊在“代理母亲”体内长至35天时，采用外科手术获取其脑组织，继而在体外培养得到EdNSC。这样对于与CL-4同一批次的克隆羊来说，所得到的EdNSC及克隆羊的AdNSC排除表观遗传学因素，可认为是“自体NSC”；而非克隆羊的AdNSC是“异体NSC”。我们对所得到的这三类NSC通过Nestin鉴定后，用绿色荧光蛋白(GFP)进行标记以用作移植治疗。另外在NSC培养过程中发现EdNSC体外培养速度比AdNSC快。在本实验的第二部分中，我们随机选取与CL-4同一批次的CL系列克隆羊20只。通过外科手术开颅暴露出克隆羊大脑上薛氏沟周围的运动皮层区，然后使用50g×100cm力度作自由落体加速撞击，建立起观察指标明确的克隆羊脑挫裂伤模型。第三部分中，我们将已建立模型的动物随机分成四组，分别用第一部分所得到的三类NSC：克隆羊的EdNSC、AdNSC和非克隆羊的AdNSC以及生理盐水进行移植治疗。观察比较移植治疗后各组动物的存活率；行为学恢复情况；脑损伤对侧肢体运动功能恢复情况及运动诱发电位的恢复情况；并测定各组动物头颅MRI影像学及病理显微观的改变；同时比较移植到脑内的各类神经干细胞在动物脑内的存活、迁移、分化情况。结果发现：克隆羊EdNSC、AdNSC移植组与非克隆羊AdNSC移植组及对照组相比，动物的存活率、行为学恢复情况及脑损伤灶对侧肢体运动功能恢复情况及运动诱发电位的恢复情况明显提高；头颅MRI影像学及损伤区域病理显微观表现明显改善；移植到脑内的神经干细胞均可良好存活、迁移、分化；这两组比较而言，EdNSC的移植治疗效果相对更好一些，表现在脑损伤灶对侧肢体运动功能恢复更快；影像学及病理显微观显示脑挫裂伤灶吸收、恢复更快。而非克隆羊AdNSC移植组与对照组相比，移植治疗效果差别不大。在实验的第四部分中，我们专门对各类NSC移植治疗中枢神经系统损伤后的免疫排斥反应问题进行了研究。实验中我们检测了细胞移植前后不同时间点(造模前1天、细胞移植前、细胞移植后3天、1个月及3个月时)各组动物血液中细胞因子(IL-2，IL-6，IL-10)水平，以及细胞移植后急性期(细胞移植后1周)和慢性期(细胞移植后3个月)，移植局部病理切片中CD3+细胞浸润的免疫组化染色情况，力争从全身和移植局部两个方面探讨各类神经干细胞移植后免疫排斥反应这一问题。结果发现：非克隆羊AdNSC组移植后3天、1个月、3个月时IL-2水平较其它组明显升高(P＜0.05)；细胞移植3个月时该组动物血中IL-6水平较其它组明显升高(P＜0.05)；而在移植后3天、1个月、3个月时该组动物血中IL-10水平较其它组明显下降(P＜0.05)。而克隆羊EdNSC及AdNSC移植组之间及它们与对照组相比，各时间点动物血液中细胞因子(IL-2，IL-6，IL-10)水平均没有统计学差异(P＞0.05)。非克隆羊AdNSC(异体细胞移植组)在细胞移植后的急性期(移植后1周)和慢性期(移植后3个月)，移植局部CD3+细胞的数量明显比其它组多【与其它组相比有统计学差异(P＜0.05)】，说明该组移植部位发生了免疫排斥反应。而两个“自体”细胞移植组(克隆羊EdNSC和AdNSC移植组)，移植局部CD3+细胞的数量与对照组相比无明显的增多，这说明这两个“自体”神经干细胞移植组局部未发生明显免疫排斥反应。这两个“自体”细胞移植组之间相比，可以看到EdNSC组CD3+细胞的数量稍多，但二者之间没有统计学差异(P＞0.05)。综上，通过本实验我们得出了以下结论：1对胚胎克隆羊、成体克隆及非克隆羊通过外科手术取其皮层脑组织，在体外培养均能得到生长良好的胚胎神经干细胞(EdNSC)及成体神经干细胞(AdNSC)。在相同的条件下，EdNSC体外培养速度比成AdNSC快。2对羊脑上薛氏沟周围运动皮层区使用50g×100 cm力度作自由落体加速撞击，可产生观察指标明确且存活率高的羊脑挫裂伤模型，有望广泛用于神经干细胞移植及药物等治疗的实验研究。3胚胎神经干细胞(EdNSC)及成体神经干细胞(AdNSC)移植治疗脑挫裂伤后均有较明显的治疗效果；二者相比较而言胚胎神经干细胞(EdNSC)稍好于成体神经干细胞(AdNSC)。4中枢神经系统异体神经干细胞移植存在着明显的免疫排斥反应，而自体神经干细胞移植基本无免疫排斥反应