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溶酶体膜通透(lysosomal membrane permeabilization；LMP)是细胞凋亡的关键事件之一。溶酶体膜发生膜通透后，多种蛋白酶从溶酶体释放至胞浆中，并通过作用于下游底物引起细胞凋亡。本实验室经过长期探索，从大鼠肝脏的溶酶体中纯化、鉴定出胰凝乳蛋白酶，该酶能够在中性pH条件下高效剪切并活化Bid，继而通过线粒体途径诱导细胞凋亡。
长期以来胰凝乳蛋白酶一直被认为是胰脏外分泌的消化酶，而本实验室的研究结果提示其还存在于肝细胞中，并作为信号分子执行重要功能。在此基础上，本论文系统探索了胰凝乳蛋白酶的分布广泛性，深入研究了溶酶体释放胰凝乳蛋白酶继而参与凋亡调控的机理，并探讨了细胞凋亡过程中溶酶体膜通透的可能机制。
首先，本论文建立了一套用于快速表达及纯化重组人源胰凝乳蛋白酶的实验体系，并得到了毫克级的高活性重组蛋白；以此纯化蛋白为抗原制备了抗胰凝乳蛋白酶的抗体，并通过自制的抗体对胰凝乳蛋白酶蛋白在大鼠及人各组织中的表达与分布进行了分析。实验结果表明，胰凝乳蛋白酶不仅在胰脏、小肠、胃等消化组织中高水平表达，同时也广泛表达于脾、肺、心脏、肝、大脑、小脑、肾、卵巢、睾丸等非消化组织中，提示其可能具有更广泛的生理作用。
在此基础上，本论文以胰凝乳蛋白酶表达水平较高的肝细胞为模型，研究了胰凝乳蛋白酶参与凋亡调控的机理。在H2O2诱导RH-35鼠肝瘤细胞凋亡的过程中，溶酶体膜发生通透，释放胰凝乳蛋白酶，在此过程中伴有凋亡酶8的短暂激活及Bid的持续剪切。用凋亡酶8的抑制剂IETD处理细胞或下调Bid的表达均可显著抑制溶酶体膜通透、减少溶酶体释放胰凝乳蛋白酶，提示凋亡酶8及tBid是溶酶体膜通透的上游因子。与溶酶体相比，线粒体发生外膜通透需要更高浓度的tBid。由短暂激活的凋亡酶8所产生的低浓度的tBid可引起溶酶体膜通透，溶酶体释放出的胰凝乳蛋白酶可高效剪切Bid，导致胞浆中tBid水平持续增加，继而通过正反馈放大环路引起更高程度的溶酶体膜通透，并最终引发线粒体外膜通透(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)。此外通过野生型小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)及Bax-/-/Bak-/-双敲除的MEF细胞比较了tBid、Bax等Bcl-2家族成员引发溶酶体膜通透及线粒体外膜通透作用的异同，结果证明tBid单独即可诱发LMP，而MOMP则需要tBid及Bax/Bak的共同参与。
上述实验结果已经充分证明溶酶体释放的胰凝乳蛋白酶可介导细胞凋亡，然而溶酶体膜通透的具体机制仍然有待研究。基于本实验室在膜脂-蛋白质相互作用引发MOMP的前期工作基础，以及tBid可单独引发LMP这一前期发现，本论文着重探索了tBid通过膜脂-蛋白质相互作用诱导LMP的具体机制。首先我们分析了溶酶体膜的磷脂组成，发现溶酶体膜富含磷脂酸(PA)等酸性磷脂。基于这一结果，我们使用含有酸性磷脂的模型膜系统(大单层脂质体)模拟溶酶体膜，研究tBid与膜的相互作用。BIAcore实验显示酸性磷脂(特别是PA)可以与tBid发生直接的膜脂-蛋白质相互作用；同时，tBid可以更有效地诱导含有酸性磷脂(特别是PA)的大单层脂质体泄漏并释放内容物。基于这些发现我们推测酸性磷脂可以通过静电相互作用与tBid在溶酶体膜上发生相互作用。由于tBid诱导内容物的释放能力反比于包裹物的大小，因此我们推测tBid通过形成孔道的方式诱导溶酶体膜发生通透。通过检测tBid的寡聚化行为，我们发现tBid可在溶液中自发形成二聚体，插入含有PA等酸性磷脂的脂质体膜并发生构象改变，进一步寡聚化，最终导致LMP的发生。详细机理有待进一步探索此外通过31P-NMR发现tBid可以使含有PA的脂质体发生脂双层向非片层相转变的倾向。
以上研究结果提示胰凝乳蛋白酶广泛表达于非消化组织细胞的溶酶体中并参与细胞凋亡。在细胞凋亡过程中凋亡酶8将Bid剪切活化为tBid，tBid通过与酸性磷脂PA的相互作用转移到溶酶体上并触发LMP、促进溶酶体释放胰凝乳蛋白酶；胰凝乳蛋白酶进一步剪切并活化Bid，最终通过正反馈放大途径引发细胞凋亡。