猪十种常见疫病病毒多重PCR和基因芯片检测方法的研究

• 作 者: 罗宁
• 机 构: 青岛农业大学
• 出 处: 青岛农业大学
• 发表日期: 2017年期
• 关键词: 生猪养殖 病毒感染 家畜免疫 基因测序

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）、猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus2, PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV）、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine trans-miscible gastroenteritis of swine, TGEV)、猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)、猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus, PCMV）和口蹄疫病毒(Food-and-mouth disease virus, FMDV)是猪养殖业中常见的十种疫病病原。近年来，猪疫病日益呈现复杂化和严重化的发展趋势，多种病毒混合感染的比重增加，这一现状增大了临床诊断和实验室诊断的难度。因此建立这十种病毒的快速检测技术，来加强对这些病毒引起的猪疫病的流行动态及分布研究，以及减少养猪业经济损失，促进其健康发展，具有极为重要的意义。　　本研究主要内容包括：⑴根据GenBank中已发表的CSFV毒株、PRRSV美洲型毒株、TGEV毒株、PEDV毒株、PRV毒株、PCV-2毒株、FMDV毒株、SIV、H1N1、H3N2毒株、PPV毒株和PCMV病毒株基因序列，对各病毒基因区进行同源性分析，选择保守区域设计合成10对特异性引物，然后进行单基因PCR反应验证其特异性，在此基础上建立和优化了10种病原的两个多重PCR检测体系，其最低检测限度可达104 copies/μL。分别用多重PCR和普通PCR、RT-PCR检测145份临床病料，符合率为97.93%，结果表明该检测技术适用于临床病料的检测及快速诊断，具有较大的实际意义和应用价值。⑵通过序列分析、靶标与探针杂交试验、杂交条件优化试验建立了猪十种常见疫病病毒基因芯片的检测方法，根据CSFV、美洲型PRRSV、TGEV、PEDV、A型SIV、PRV、PPV、PCV-2、PCMV和FMDV核酸的保守区域，设计10对特异性引物，将扩增纯化后的靶基因点制成芯片，通过Cy3标记的特异性引物扩增病毒核酸制备探针，再与芯片杂交，扫描分析结果。通过对芯片杂交条件的优化，发现在点样靶基因浓度400μg/mL、杂交条件为55℃时与探针杂交2h的情况下，可获得理想的杂交结果。试验结果表明芯片检测十种病毒特异性好、灵敏度高，最低检测限度可达105 copies/μL，应用基因芯片技术和普通PCR/RT-PCR、多重PCR检测临床病料32份，芯片检测与普通PCR的符合率为93.75%，与多重PCR的符合率为90.63%。初步研究表明，应用DNA芯片技术可同时同步检测多种猪疫病病毒，且该方法为临床病料的初步诊断提供了一个新的、可靠性方法。⑶将基因芯片检测技术应用于动物疫病的检测，成功构建了猪常见10种疫病病毒的多重PCR检测技术和基因芯片检测技术平台，为今后利用基因芯片技术进行动物病毒病诊断和研究提供理论依据，也为控制和消灭疫情奠定了基础，具有重大的理论意义和应用价值。