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目的: 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是发生于我国南方及东南亚地区最为常见的恶性肿瘤之一，其年发病率在30～80/10万，尤其以广东为甚。临床上鼻咽癌以高转移、高复发和低分化为显著特征，将近88.0％的鼻咽癌患者初诊时已有颈部淋巴转移，颈淋巴结转移被视为鼻咽癌发病的显著特征之一。转移是鼻咽癌有效治疗需要克服的重大难题，而鼻咽癌转移的确切机制仍不明确，进行相关机制的研究具有现实意义。鼻咽癌转移是一个多因素、多步骤的复杂过程，EB病毒感染及其他多种非病毒因素（如化学致促癌物）参与鼻咽癌发生、发展和转移。课题组前期工作表明二亚硝基哌嗪（DNP，N，N-Dinitrosopiperazine）与丛生蛋白（CLU，Clusterin）在鼻咽癌发生、发展和转移中起促进作用。但DNP调节CLU参与鼻咽癌转移的确切分子机理仍不清楚。 前期研究发现，DNP通过活化多个信号分子，促进鼻咽癌细胞侵袭迁移，CLU是其中的一个重要分子，推断DNP可以介导CLU表达参与鼻咽癌转移。本文以低转移潜能鼻咽癌细胞6-10B和高转移潜能鼻咽癌细胞5-8F为研究模型，探讨DNP介导CLU高表达参与鼻咽癌转移的分子机制。本文第一部分应用免疫组织化学和酶联免疫吸附的方法，分析了CLU在鼻咽癌组织和血清中的表达情况，从组织和血清学的层面明确CLU与鼻咽癌发生、发展、转移的关系。第二部分应用分子克隆、基因转染、基因干扰、Real-time PCR和Western Blotting等技术研究CLU对鼻咽癌细胞侵袭转移的影响。第三部分通过Transwell迁移及侵袭实验、Real-time PCR和Western Blotting等技术考察DNP通过介导CLU/MMP-9、VEGF表达对鼻咽癌细胞生物学功能和行为的影响，从而阐明DNP可以诱导CLU/MMP-9、VEGF表达参与鼻咽癌转移的分子机制，为探讨鼻咽癌高转移的分子机理以及鼻咽癌筛查诊断的血清标志物、转移的检测和靶向治疗候选分子的筛选提供有价值的参考和依据。 方法: (1)免疫组化检测鼻咽癌患者组织中CLU、MMP-9、VEGF表达水平，分析组织中CLU、MMP-9、VEGF表达水平与鼻咽癌发生发展转移的关系。 (2)荧光定量检测试剂盒分析鼻咽组织中MMP-9酶活性，分析组织中MMP-9酶活性与鼻咽癌侵袭转移的关系。 (3)ELISA法检测鼻咽癌患者血清中CLU的表达水平，分析CLU血清学水平与临床鼻咽癌转移的关系。 (4)将不同浓度DNP处理6-10B细胞，MTT实验分析DNP处理6-10B细胞的非毒性浓度(NCC)。全自动生化仪检测DNP处理6-10B细胞培养液的乳酸脱氢酶(LDH)，进一步验证DNP非毒性浓度。 (5)分析DNP处理组和对照组细胞CLU、MMP-9、VEGF蛋白质表达，明确DNP诱导CLU、MMP-9、VEGF表达。 (6)应用分子克隆技术成功构建了CLU过表达载体pcDNA3.1(+)-CLU及shRNA表达载体pSR-GFP/Neo-CLU-shRNA，为后续研究做准备。 (7)将过表达载体pcDNA3.1(+)-CLU转染6-10B细胞，筛选稳定克隆株。Western Blotting检测对照组和转染组之间CLU、MMP-9、VEGF蛋白质表达，Transwell迁移与侵袭实验分析CLU表达对6-10B细胞迁移和侵袭能力的影响。 (8)将表达载体pSR-GFP/Neo-CLU-shRNA转染5-8F细胞，Western Blotting检测对照组和转染组之间CLU、MMP-9、VEGF蛋白质表达。Transwell迁移与侵袭实验分析CLU沉默表达对5-8F细胞迁移和侵袭能力的影响。 (9)Transwell迁移与侵袭实验分析DNP诱导CLU表达对6-10B细胞迁移和侵袭能力的影响，Western Blotting检测各细胞组CLU、MMP-9、VEGF蛋白质表达，明确DNP是否促进鼻咽癌细胞的运动迁移和侵袭。 (10)应用SPSS19.0软件对实验结果和数据进行统计分析。 结果: (1)免疫组织化学技术检测了14例正常鼻咽组织、144例鼻咽癌组织中CLU、MMP-9、VEGF表达。结果显示CLU、MMP-9、VEGF蛋白表达与鼻咽癌患者的性别、年龄无显著相关性，无统计学意义(P＞0.05）;与TNM分期有显著相关性，存在统计学意义(P＜0.05）。 (2)荧光定量检测试剂盒分析鼻咽组织中MMP-9酶活性。结果显示MMP-9酶活性在T3-4期中的表达明显高于T1-2期，在N1-3期中的表达明显高于N0期，在M1期中的表达明显高于M0期。初步明确MMP-9酶活性与鼻咽癌TNM分期存在显著的相关性。 (3)ELISA法检测鼻咽癌患者血清中CLU水平，考察并明确血清CLU水平与鼻咽癌发生发展及转移的关系。实验收集检测了健康对照组(Contorl)42例、鼻咽癌组(NPC)124例，两组血清的CLU浓度Median(min-rnax)分别为1.87(0.16-42.88) ng/mL、5.41(1.38-123.78) ng/mL，两组之间存在显著差异(P＜0.01)。同时分析了鼻咽癌组血清CLU表达水平与性别、年龄、抽烟、饮酒、TNM分期、复发、Rta-IgG表达水平等的关系，结果显示Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期鼻咽癌患者血清CLU浓度Median(min-max)分别为4.69(2.15-109.46)ng/mL、6.07(1.38-123.78)ng/mL;未复发组、复发组鼻咽癌患者血清CLU浓度Median(min-max)分别为4.69(2.03-109.46)ng/mL、7.59(1.38-123.78)ng/mL，CLU与TNM分期、复发有显著相关性，存在统计学意义(P＜0.05）。进一步采用Kaplan-Meieranalysis和the log-rank test统计学分析CLU表达和鼻咽癌患者预后的关系，CLU高表达鼻咽癌患者的总生存期和无瘤生存期比CLU低表达的患者短，CLU高表达预示鼻咽癌患者预后不良。 (4)MTT实验结果表明，DNP在0-100.0μmol/L时，对6-10B细胞的生长没有明显影响(P＞0.05)。0-100.0μmol/L是DNP处理6-10B细胞的非毒性浓度。 (5)应用分子克隆技术成功构建了CLU过表达载体pcDNA3.1(+)-CLU及shRNA表达载体pSR-GFP/Neo-CLU-shRNA。分别将表达载体pcDNA3.1(+)-CLU转染6-10B细胞，pSR-GFP/Neo-CLU-shRNA转染5-8F细胞，Western Blotting及RT-PCR分析显示对照组和转染组之间CLU蛋白及mRNA表达存在差异(P＜0.05)。 (6)Western Blotting分析DNP处理后鼻咽癌细胞CLU、MMP-9、VEGF表达，结果表明应用不同浓度DNP或在不同时间处理6-10B细胞，CLU、MMP-9、VEGF的表达显著增强(P＜0.05)，呈现处理时间依赖性和剂量依赖性。 (7)Transwell迁移和侵袭实验分析DNP处理CLU阻断鼻咽癌6-10B细胞迁移侵袭能力的变化。实验结果表明，DNP对6-10B细胞的运动迁移和侵袭能力起明显增强作用，且阻断CLU后，DNP诱导6-10B细胞的运动迁移能力降低(P＜0.05)。 (8)免疫荧光双标法分析DNP对6-10B细胞CLU与MMP-9或VEGF表达的影响。DNP处理组中CLU、MMP-9、VEGF的荧光强度明显增强，表达集中在细胞浆局部区域，结果提示CLU与MMP-9或VEGF有共定位现象。 (9)免疫共沉淀实验(Co-immunoprecipitation)分析细胞内源性CLU与MMP-9或VEGF蛋白相互作用，结果发现在DNP处理6-10B实验组中内源性CLU与MMP-9或VEGF蛋白存在相互结合现象。 结论: (1)DNP通过介导CLU高表达，增强鼻咽癌细胞侵袭和迁移，提示DNP作为化学致癌剂可能是鼻咽癌高转移重要的诱因之一;CLU可能是鼻咽癌转移中一个重要的信号分子。 (2)鼻咽癌组织和血清CLU检测表明，CLU与TNM分期、复发有显著相关性，提示CLU表达上调与鼻咽癌的发展、转移有关，可以作为鼻咽癌进展和治疗预后判断的候选标志物。 (3)DNP可能通过CLU/MMP-9、VEGF信号通路，增强鼻咽癌细胞侵袭和迁移。CLU可能是鼻咽癌转移中重要的信号分子。