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重组人复合α干扰素突变体R164S(Consensus interferon-α mutant，cIFN)是将复合α干扰素164位精氨酸突变成丝氨酸后得到的，主要是考虑防止被蛋白酶降解。
课题组前期研究发现在发酵罐中采用合成培养基诱导毕赤酵母Pichia pastoris表达cIFN时依然不稳定，有大量的降解出现，聚合情况也较为严重，同时伴有发酵液中cIFN呈现双带(SDS—PAGE非还原电泳)现象。本课题立足于发酵液中cIFN不稳定性机理研究，希望以此找到有效防止其降解和聚合的办法。
本论文中我们首先进行发酵条件优化来尝试解决cIFN降解和聚合问题。采用复合培养基15℃低温诱导，发现细胞可以接近高密度生长，66小时放罐时生物量干重接近80g/L，同时实现了cIFN为1.23g/L的高水平表达，并有效解决了cIFN降解的问题。经优化cIFN最大比活达到2.26×108IU/mg，较前期合成培养基BSM诱导提高了50％以上，在此基础上进一步添加Tween-80有效解决了cIFN聚合问题，最大比活达到7.35×108IU/mg，cIFN单体含量达到80％以上。鉴于cIFN稳定性差，通过甲醇浓度对cIFN表达影响的研究，发现甲醇浓度不仅影响cIFN表达水平还会影响其在发酵液中的稳定性。当甲醇浓度维持在0.75％时细胞生长最快，cIFN表达量最高达2g/L，但cIFN稳定性很低，单体含量仅为25％，远远小于甲醇浓度为0.25％的70％的单体含量。另外甲醇浓度在0.75％时比生长速率最大，但cIFN比产率却小于甲醇浓度为0.25％的比产率，说明比生长速率并非越大越好。还发现甲醇浓度为0.75％时存在明显的cIFN双带现象(非还原SDS—PAGE电泳显示为非常接近的两条蛋白条带)，相应的也更容易发生外源蛋白的降解和聚合。
本研究还考察了发酵环境条件对后续分离纯化的影响。发现在20℃诱导发酵得到的cIFN分离纯化极其困难，必须经过硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换层析和分子筛层析才能得到cIFN纯品，得率相对于总蛋白来说只有3.7％。在15℃诱导得到的发酵液分离纯化cIFN非常容易，仅经过离子交换柱层析和分子筛层析就可以得到95％左右纯度的cIFN纯品，蛋白得率为29.4％，达到20℃诱导时的8倍左右。对不同诱导温度的发酵液分析后发现cIFN在不同的发酵液中稳定性不同，即在20℃诱导时cIFN大量地产生聚合和降解，发酵液中cIFN单体量非常少，只有15℃诱导的五分之一，同时还发现cIFN进行非还原SDS—PAGE也是以双带形式存在，而15℃诱导则是以单一条带存在的，由此推测cIFN降解和聚合可能和其单体结构形式有关。
由于频繁出现cIFN双带现象，同时伴有严重的降解和聚合，我们进一步系统地研究了cIFN结构变化和降解聚合之间的关系。首先采用电泳、RP—HPLC和质谱的方法确定发酵液中cIFN双带为二硫键结构不同的异构体。采用本论文自创的蛋白质梯度条带对比法(Protein Laddering Map)进一步快速鉴定了双带中上面条带为含一对二硫键的cIFN，下面条带为含完整二硫键(二对二硫键)的cIFN。在此基础上我们通过体外控制适当的巯基乙醇浓度分别得到含不同二硫键的cIFN单体：含二对二硫键单体，含一对二硫键单体和不含二硫键的单体。经不同结构单体聚合降解实验发现即使分子内二硫键的轻微破坏对cIFN稳定性影响都是致命的。cIFN分子内二硫键破坏后产生了三种不同的聚合：二硫键共价聚合，疏水聚合和一种在还原SDS—PAGE上都打不开的二聚体聚合，同时也会导致cIFN降解更迅速，其聚合和降解程度和二硫键破坏程度成正相关。由此可见发酵液中含有分子内二硫键断裂的cIFN是诱发其聚合和降解的主要原因。当在15℃诱导表达时，发酵液中基本上都是含完整二硫键的cIFN，相应的此时降解消失聚合也明显减轻。我们通过电镜观察还发现cIFN疏水聚合和共价聚合形态完全不同，疏水聚合形成的是菱形晶体状聚合体，而共价聚合则呈现明显的棉花絮状聚合体。
为了澄清二硫键不正确折叠cIFN的来源，我们采用本论文自创的PLM方法对细胞内部不同部位的cIFN进行结构分析。分别分析了发酵液中，ER膜上和细胞质中的cIFN结构。发现在较高温度如20℃诱导时的发酵液中cIFN进行非还原SDS—PAGE电泳时有双带发生，此时细胞质中cIFN电泳结果也存在有明显的双带，而在15℃诱导时经电泳没有出现双带，此时细胞质中cIFN经电泳分析也不存在双带，因此可以推断二硫键结构不正确的cIFN是在细胞内产生并分泌到细胞外。进一步进行不同比生长速率恒化实验发现，在较低的比生长速率如0.01h-1时细胞分泌cIFN量较高比生长速率0.027h-1时要多，并且结构也是完整的，而高比生长速率时有不完整结构的cIFN产生，相应的胞内也是这样的情况。因此我们认为是细胞生长速率影响了cIFN的表达及其结构变化。以此理论为指导我们采用不同比生长速率进行分批发酵实验研究，结果在较低比生长速率下发酵液中基本上都是正确折叠的cIFN，而在高比生长速率下出现了明显的错误折叠的cIFN(电泳显示双带)。我们认为在较高比生长速率下细胞由于快速生长需要大量合成自身需要的内源蛋白，而这是以牺牲外源蛋白的表达和质量保证为代价的。在较高温度下(20℃)和较高甲醇浓度下(0.75％)会形成二硫键结构不正确的cIFN(非还原电泳为双带)，其本质原因就是细胞的快速生长导致的。而在15℃诱导细胞生长较为缓慢，同时低温环境也对细胞生理(细胞死亡率降低等)有非常正面的影响，在多重因素作用下cIFN可以得到快速正确的表达。
我们还通过免疫透射电子显微镜分析了cIFN在细胞内部表达运输情况。发现cIFN表达也经历了一个从初始到高潮到接近停止的阶段。在细胞初期cIFN表达量少，可以及时运出胞外。随着分泌的增加细胞转运cIFN跨过细胞膜和细胞壁显然成了瓶颈，电镜可以清晰地观察大量的cIFN聚集在周质空间中。随着细胞衰老细胞质中cIFN逐渐减少，周质空间的cIFN也逐渐分泌出去。我们还发现在细胞质中就已经存在有明显的聚合体，并且可以转运细胞外。由于胞内高度的还原环境，我们认为这些聚合体应该是cIFN疏水聚合体，而当分泌到胞外后则非常有可能转变成二硫键共价聚合体。