【摘 要】
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目的:探究EgRPS9、EgRad9和EgTPx基因在青蒿素致细粒棘球蚴DNA氧化损伤过程中的功能作用。方法:1.克隆EgRPS9、EgRad9和EgTPx全长基因，分别构建其克隆载体和表达载体，通过PCR、双酶切及测序技术进行鉴定。2.(1)电穿孔法分别将EgRPS9-siRNA、EgRad9-siRNA和EgTPx-siRNA的三条干扰序列转染细粒棘球蚴，以细粒棘球蚴体外耐受H2O2干预的最大浓度进行干预，构建DNA氧化损伤阳性模型，根据活性检测及qRT-PCR结果从中筛选各基因干扰效果较好的siRN
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目的:探究EgRPS9、EgRad9和EgTPx基因在青蒿素致细粒棘球蚴DNA氧化损伤过程中的功能作用。方法:1.克隆EgRPS9、EgRad9和EgTPx全长基因，分别构建其克隆载体和表达载体，通过PCR、双酶切及测序技术进行鉴定。2.(1)电穿孔法分别将EgRPS9-siRNA、EgRad9-siRNA和EgTPx-siRNA的三条干扰序列转染细粒棘球蚴，以细粒棘球蚴体外耐受H2O2干预的最大浓度进行干预，构建DNA氧化损伤阳性模型，根据活性检测及qRT-PCR结果从中筛选各基因干扰效果较好的siRNA干扰序列。(2)用筛选所得的siRNA转染细粒棘球蚴，联合细粒棘球蚴体外耐受H2O2的最大浓度干预，采用单细胞凝胶电泳(Single cell gel eletrophoresis，SCGE)和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)含量检测干扰前后细粒棘球蚴DNA损伤程度及体内ROS含量的变化。3.筛选所得的各基因siRNA干扰序列转染细粒棘球蚴，协同细粒棘球蚴体外耐受青蒿素的最大浓度干预，通过活性检测、超微结构观察、基因表达水平检测、蛋白表达水平检测及DNA氧化损伤指标检测，综合分析各基因在青蒿素致细粒棘球蚴DNA氧化损伤过程中的功能作用。结果:1.EgRPS9、EgRad9和EgTPx的PCR扩增产物大小分别为564bp、1365bp和670bp,PCR、双酶切及测序结果表明各基因的表达载体构建成功。2.(1)自然状态下细粒棘球蚴体外耐受H2O2干预的最大浓度为0.4mM，干预时间为1h;结合存活率、碱性磷酸酶及qRT-PCR结果，筛选确定各基因干扰效果较好的序列为EgRPS9-siRNA-448、EgRad9-siRNA-614和EgTPx-siRNA-60。(2)SCGE结果显示各干扰组细粒棘球蚴形成拖尾，尾距OTM值均高于H2O2干预组，差异有统计学意义(P＜0.05);各干扰组细粒棘球蚴体内ROS含量均高于H2O2干预组，差异有统计学意义(P＜0.05)。3.自然状态下细粒棘球蚴体外耐受青蒿素干预的最大浓度为0.8mM，干预时间为1h;特异性干扰目的基因表达并协同青蒿素干预后，各干扰组细粒棘球蚴的存活率和碱性磷酸酶活性均低于青蒿素干预组，差异均有统计学意义(P＜0.05);扫描电镜表面超微结构观察显示各干扰组细粒棘球蚴表面毛糙、塌陷，微绒毛排列紊乱，虫体固缩且表皮层呈现虫蚀样改变;透射电镜内部超微结构观察显示各干扰组细粒棘球蚴结构破坏严重，脂滴增多，细胞核崩解，出现异染色质;qRT-PCR结果显示各干扰组EgRPS9-mRNA、EgRad9-mRNA和EgTPx-mRNA的表达水平分别与相应的青蒿素干预组相比均显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.01);Westernblot结果显示EgRPS9、EgRad9和EgTPx蛋白表达量分别与相应的青蒿素干预组相比均显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.01);SCGE显示各干扰组细粒棘球蚴均有拖尾现象，尾距OTM值均高于青蒿素干预组，差异均有统计学意义(P＜0.05);ROS含量检测结果显示各干扰组ROS含量均高于青蒿素干预组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论:DNA氧化损伤是青蒿素抗细粒棘球蚴的作用机制之一，EgRPS9、EgRad9和EgTPx基因可以修复青蒿素通过产生ROS对细粒棘球蚴造成的DNA氧化损伤，干扰EgRPS9、EgRad9和EgTPx基因的表达，能增强青蒿素抗细粒棘球蚴的药效。
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