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镉是重要的环境污染物。大量研究证实,职业和环境镉暴露与人类男性不育及精子质量下降有关。甚至精液中很低浓度的镉都有可能通过减少精子质量引起男性不育。镉对啮齿动物同样具有睾丸毒性。镉能够诱导成年雄性大鼠或小鼠出现明显的睾丸损伤、精子数量减少、精子活力下降甚至不育。镉能够引起成年雄性大鼠或小鼠睾丸生殖细胞凋亡,然而关于镉诱导睾丸生殖细胞凋亡的分子机制目前尚不清楚。而且对生命发育不同阶段特别是胚胎器官和组织形成“关键期”镉暴露对子代雄鼠的生殖毒性和内分泌干扰作用及其分子机制远未阐明。本课题主要探讨不同发育阶段雄性小鼠接触氯化镉对睾丸发育及精子发生的影响,阐明生命发育关键期接触氯化镉对雄性生殖内分泌干扰作用的分子机理;重点阐明ROS介导的内质网应激在镉诱导的小鼠睾丸生殖细胞凋亡中的作用。1.孕期母体镉暴露对子代雄鼠生殖发育的影响目的:研究孕期母体镉暴露对雄性仔鼠睾丸发育及精子发生的影响,初步探讨镉诱导雄性小鼠生殖发育损害作用的机理。方法:孕鼠随机分成对照组和镉处理组,处理组孕鼠于受孕第1317天（GD13-17）经腹腔注射给予CdCl2（0.5 mg/kg）,对照组孕鼠给予等容积生理盐水（NS）,在GD18和子鼠出生后第70天（PND70）随机剖杀子代雄鼠。取睾丸称重并进行组织病理学检查;采用免疫组化方法标记3β-HSD计数睾丸间质细胞;采用TUNEL方法检测睾丸生殖细胞凋亡;采用放免方法检测血清和睾丸睾酮水平;采用RT-PCR和Western blotting技术检测雄鼠睾丸睾酮合成相关基因mRNA和蛋白表达水平;取成年雄鼠单侧附睾尾进行精子计数。结果:孕期母体镉暴露显著降低胎鼠重量和顶臀长。镉暴露组胎鼠睾丸绝对和相对重量均显著低于NS对照组。镉暴露组胎鼠血清睾酮水平明显降低。在镉暴露组胎鼠睾丸StAR、P450scc、P45017α和17β-HSD mRNA与蛋白表达显著下调。镉暴露组胎鼠血中仅检测到微量镉,而胎盘镉含量却比NS对照组升高750倍。这些结果表明,胎盘屏障阻止镉从母体进入胎鼠。结论:孕期母体镉暴露可能会损害胎儿期的睾丸发育及睾酮合成,胎盘能够阻止大部分镉从母体转运给胎鼠。孕期母体镉暴露引起的胎鼠睾丸发育及睾酮合成损害不能完全归因于镉对胎鼠睾丸的直接作用。孕期母体镉暴露引起的雄性生殖损害可能与镉致胎儿生长发育迟缓有关。2.哺乳期母体镉暴露对子代雄鼠生殖发育的影响目的:探讨哺乳期母体镉暴露对雄性仔鼠睾丸发育及精子发生的影响。方法:哺乳期母鼠随机分成对照组和镉处理组,处理组母鼠于子鼠出生后第121天每天经腹腔注射给予CdCl2（1.0 mg/kg）,对照组母鼠给予等容积生理盐水,在PND 22、70随机剖杀子代雄鼠。取睾丸称重并进行组织病理学检查;取成年雄鼠单侧附睾尾进行精子计数;采用免疫组化方法标记3β-HSD计数睾丸间质细胞;采用TUNEL方法检测睾丸生殖细胞凋亡;采用放免方法检测血清和睾丸睾酮水平;采用RT-PCR和Western blotting技术检测雄鼠睾丸睾酮合成相关基因mRNA和蛋白表达水平。结果:哺乳期镉暴露能够明显增加母鼠全血镉含量,而镉处理组断乳期及成年后仔鼠生物样品中镉含量与NS对照组相比无明显差异。母鼠哺乳期镉暴露对断乳期仔鼠及成年仔鼠睾丸重量、血清和睾丸组织睾酮水平、睾丸组织StAR及睾酮合成关键酶均无明显影响。结论:母鼠哺乳期镉暴露对雄性子代睾丸发育及精子生成无明显损害效应。3.青春期镉暴露对成年后雄鼠生殖发育的影响目的探讨青春期镉暴露对成年后雄性小鼠精子发生的影响及可能机制。方法选择36只雄性ICR小鼠,随机分为处理组和对照组,于PND35至PND70,处理组小鼠每天经腹腔注射给予1 mg/kgCdCl2,对照组给予等容量生理盐水。末次染毒24小时后,小鼠被处死,取附睾尾进行精子计数,取睾丸称重并进行病理组织学检查;采用免疫组化方法标记3β-HSD计数睾丸间质细胞;采用放免法检测血清和睾丸组织睾酮水平;采用RT-PCR和Western blotting技术检测雄鼠睾丸睾酮合成相关基因mRNA和蛋白表达水平。结果青春期镉暴露显著降低成年后雄性小鼠精子数量,减轻睾丸、附睾、前列腺和精囊重量;镉处理组血清与睾丸睾酮含量明显低于阴性对照组。青春期镉暴露显著下调睾丸StAR、P450scc、P45017α和17β-HSDmRNA和蛋白表达水平。青春期镉暴露组睾丸生殖细胞凋亡发生率显著增加。结论:青春期镉暴露对小鼠成年后精子发生与睾酮合成有明显损害作用,青春期镉暴露引起的精子发生与睾酮合成损害可能与睾丸StAR和睾酮合成酶表达降低及生殖细胞凋亡有关。4.成年急性镉暴露对雄鼠生殖发育的影响目的:进一步研究镉诱导睾丸生殖细胞凋亡的分子机制,探讨ROS介导的内质网应激在镉诱导睾丸生殖细胞凋亡中的作用。方法:为探讨镉致小鼠睾丸生殖细胞凋亡和内质网应激的时间-效应关系,处理组小鼠经腹腔注射单剂量的CdCl2（2.0mg/kg）,对照组注射等容量生理盐水,镉处理后不同时点（8h、12h、24h、48h）剖杀部分小鼠,取睾丸用于分析生殖细胞凋亡和内质网应激;为探讨镉致小鼠睾丸生殖细胞凋亡及内质网应激的剂量-效应关系,处理组小鼠经腹腔注射不同剂量的CdCl2（0.5、1.0、2.0mg/kg）,对照组注射等容量生理盐水,镉处理后24 h剖杀小鼠取睾丸,分析生殖细胞凋亡和内质网应激。为进一步阐明ROS介导的内质网应激在镉暴露所致小鼠睾丸生殖细胞凋亡中的作用,分别采用化学分子伴侣4-苯基酸（PBA）、抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）和抗氧化剂褪黑素（N-乙酰- 5-甲氧基色胺,MT）预处理小鼠,研究PBA、NAC和MT对镉诱导的睾丸生殖细胞凋亡及内质网应激的保护作用。结果给予雄性小鼠CdCl2,引起睾丸生殖细胞凋亡,睾丸组织裂解型caspase-3水平增加,并有明显的时间和剂量-效应关系;镉暴露引起睾丸组织线粒体Bax表达上调,细胞色素c从线粒体释放到胞质,继而引起裂解型caspase-9表达增加;镉暴露Fas和FasL表达水平没有明显变化。镉暴露诱导小鼠睾丸裂解型XBP-1（sXBP-1） mRNA显著上升,睾丸生殖细胞核蛋白中活性XBP-1水平显著上调,并导致睾丸JNK蛋白磷酸化,提示内质网应激IRE-1信号通路被激活。镉暴露明显上调睾丸GRP78与CHOP蛋白表达,镉暴露组eIF2α磷酸化水平升高并有明显剂量-效应关系,提示ATF6和PERK信号通路被激活。内质网化学小分子伴侣PBA不仅明显减轻镉所致睾丸内质网应激和非折叠蛋白反应,而且明显抑制镉暴露所致生殖细胞凋亡,提示内质网应激介导镉引起的睾丸生殖细胞凋亡。然而,镉处理组小鼠睾丸并未检测到内质网应激凋亡信号通路特异性裂解型caspase-12,镉处理组与NS对照组之间caspase-12原蛋白水平也未见明显差异。另一实验结果发现,内质网化学小分子伴侣PBA几乎完全抑制镉引起的细胞色素c从线粒体向细胞质的渗漏,提示内质网应激和线粒体信号通路的交互作用介导镉所致睾丸生殖细胞凋亡。进一步研究发现,镉处理组小鼠睾丸GSH含量显著降低,硝化酪氨酸（3-NT）强度明显增强,并呈明显剂量-效应关系。NAC与MT明显抑制CdCl2诱导的睾丸内质网应激和非折叠蛋白反应,保护镉引起的生殖细胞凋亡。结论:内质网应激和线粒体信号通路的交互作用介导镉所致睾丸生殖细胞凋亡,活性氧在镉诱发内质网应激和随后所致睾丸生殖细胞凋亡过程起重要作用。综上所述,本课题得出如下结论:（1）生命不同阶段镉暴露对雄性小鼠睾丸发育、精子发生和睾酮合成产生损害效应不同;（2）孕期镉暴露引起雄性子代早期睾丸发育和睾酮合成损害,孕期镉暴露引起的雄性生殖损害可能与镉致胎儿生长发育迟缓有关;（3）哺乳期母体镉暴露对雄性子代生殖损害效应不明显;（4）青春期和成年早期对镉敏感,青春期镉暴露诱导生殖细胞凋亡、下调睾酮合成关键酶表达,并可能影响成年后精子发生和睾酮合成;（5）成年镉暴露诱发睾丸生殖细胞凋亡,内质网应激和线粒体信号通路的交互作用介导镉所致睾丸生殖细胞凋亡,活性氧在镉诱发内质网应激和随后所致睾丸生殖细胞凋亡过程起重要作用。