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【研究背景】癫痫是神经系统疾病中除脑血管病以外最常见的一类疾病，其发病机制非常复杂,涉及到了一系列生理、生化、遗传或者免疫等方面的变化，而神经元中的钠离子通道Scn3a基因表达上调可引起神经元兴奋性升高从而可能导致癫痫的发生。丙戊酸钠( VPA)是一种临床常用的广谱抗癫痫药，可以用来治疗各种类型的癫痫以及慢性神经痛、双相情感障碍、偏头痛等；有研究表明，VPA可以通过表观遗传或非表观遗传途径来调控脑内大量基因的表达；长期服用VPA的病人或动物模型容易出现肥胖，而肥胖相关蛋白（FTO）和体重密切相关，同时该蛋白也是一种去甲基化酶。已有研究报道FTO可作为一种RNA去甲基化酶在中枢神经系统中通过表观遗传途径参与癫痫的发生发展过程。据此我们推测 VPA可能是通过FTO介导的表观遗传途径在转录后水平调控基因表达。CpG二核苷酸上的胞嘧啶甲基化是一种常见的真核生物 DNA修饰，与癫痫在内的几种神经系统疾病发病机制有密切关系。本课题组前期研究表明，在小鼠脑的发育及惊厥发病过程中，Scn3a基因启动子上-39C位点的动态甲基化参与调控Scn3a表达，进一步的研究表明甲基化结合蛋白2（MBD2，一种去甲基化酶）可以诱导-39C位点发生去甲基化，从而增加惊厥小鼠中Scn3a的表达，提示C pG甲基化在癫痫相关基因表达调控中发挥了重要作用。据此，我们推测， VPA可能通过去甲基化酶FTO和MBD2来调控Scn3a基因的表达从而发挥其抗癫痫作用。 【研究目的】本研究通过在体实验与体外实验相结合的方法，探索了去甲基化酶FTO和MBD2参与 VPA调控Scn3a基因启动子上-39C位点的甲基化状态，从而下调Scn3a基因表达这一表观遗传途径。以期从钠通道基因表观调控的角度解释VPA的一种新型抗癫痫分子机制，为VPA的抗癫痫作用提供了新的见解，并为其开发出新的临床用途及预防副作用等提供理论依据。 【研究方法】 1.提取药物处理和/或敲降MBD2或FTO表达的Neuro-2a细胞和小鼠模型海马组织的总RNA、总蛋白； 2.采用荧光定量 PCR和 Western blot在 mRNA及蛋白水平上检测 Fto、Mbd2以及Scn3a在处理前后的变化； 3.采用重亚硫酸氢盐（BSP法）对DNA进行转换，再采用直接测序法检测VPA处理前后Scn3a启动子上-39C位点的甲基化程度； 4.构建含Mbd2基因3′UTR和含Scn3a基因野生型及其突变型启动子的荧光素酶报告基因表达，转染Neuro-2a细胞后经不同条件处理，采用双荧光素酶报告基因系统检测酶活性。 【研究结果】 1.在Neuro-2a细胞中，经0.5 mM和1 mM的VPA处理72小时后，Scn3a mRNA水平有明显下降，而在用CBZ和LTG处理的细胞中未观察到该种剂量依赖性变化； 2.在Neuro-2a细胞中，用0.5 mM的VPA处理细胞72小时后，NaV1.3蛋白水平与阴性对照组相比下降约50％； 3.为了检测VPA对Scn3a基因启动子的影响，在Neuro-2a细胞中转染了Scn3a启动子报告基因，再用VPA处理，双荧光素酶报告基因活性检测结果可见，VPA处理过的细胞中荧光素酶活性（Luc2/ Renilla）明显低于没有处理的对照组； 4. BSP法发现 Scn3a启动子-39C位点发生甲基化动态变化；进一步发现VPA可以促进-39C位点发生甲基化改变；而-39C位点突变后降低了 Neuro-2a细胞内荧光素酶报告基因的活性； 5.在Neuro-2a细胞中，用0.5 mM的VPA处理细胞72小时后，MBD2蛋白水平是阴性对照组的0.3倍；进一步实验发现 VPA处理的细胞内 MBD2 mRNA水平未发现明显差异，而 VPA处理后的细胞中 psiCHEC-MBD2-3UTR报告基因的荧光素酶活性明显低于阴性对照组； 6.在敲降细胞中的MBD2蛋白表达的情况下，发现Scn3a mRNA水平与阴性对照组相比明显降低； 7.在Neuro-2a细胞中，用0.5 mM的VPA处理细胞72小时后，Fto mRNA水平及蛋白水平均升高； 8.为了进一步研究FTO是否参与了VPA通过MBD2来调控NaV1.3这一通路，在细胞内敲降FTO蛋白表达，发现MBD2和NaV1.3水平均升高，而在敲降FTO的基础上再用VPA处理，发现VPA降低MBD2和NaV1.3表达的能力减弱； 9.在癫痫动物模型中，经过1周VPA处理后的惊厥小鼠海马组织中，Scn3a和Fto的mRNA水平是分别是惊厥小鼠组的0.6和1.4倍，但是Mbd2 mRNA水平在这两组中无明显统计学差异；用CBZ和LTG处理的惊厥小鼠体内，这三个基因均无统计学差异；经过 VPA处理后的惊厥小鼠海马中，NaV1.3和MBD2蛋白水平比惊厥小鼠组的明显降低，然而 FTO的蛋白水平却比惊厥小鼠组的升高了。 【结论】本研究发现，丙戊酸钠（VPA）可通过诱导Scn3a基因启动子上-39C位点的甲基化，导致其启动子活性下降从而下调 Scn3a基因的表达，而去甲基化酶 FTO和MBD2均参与了这一过程；体内实验也验证了癫痫模型及VPA处理后这些基因的表达改变与体外实验一致，从而揭示丙戊酸钠（VPA）通过表观遗传途径下调Scn3a表达的分子机制及其在抗癫痫作用中发挥重要作用。