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研究背景及目的牙周病是人类最常见的口腔疾病之一,约80%-90%的成年人患有不同程度的牙周疾患。目前,牙周炎已成为成人失牙的首要原因。经典理论认为,牙周病是由牙菌斑及其代谢产物(如脂多糖)作用于牙周组织,并通过激活宿主的炎症免疫反应,使牙周组织发生炎症甚至坏死的一种急慢性反复发作的进展性炎症性疾病。牙周病的发生与菌斑内的细菌,尤其是革兰氏阴性(G-)菌的集聚密切相关,而内毒素作为G-菌细胞壁外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)成分,是G菌独有的一类高度活性的致病物质,对牙周组织具有很高的毒性和抗原性,在牙周病的发生发展过程中起重要作用。尽管LPS的化学组成在不同的微生物之间有所不同,但其基本结构是相似的。LPS由三种在结构及生物活性上都不相同的成分组成,即类脂A、0-特异性多糖链、核心寡聚糖。机体靶细胞在受到LPS刺激后能产生内源性调节因子,在体内形成一个细胞因子网络。在LPS生物学活性表达过程中,这些细胞因子起着十分重要的作用。LPS致病能力的强弱,在一定意义上体现在其刺激机体产生内源性细胞因子的能力。IL-1p在炎症反应和免疫应答中起重要的调节作用,具有刺激其他炎性因子产生和补体激活的作用。IL-6可以调节急性期蛋白的产生,促进炎症细胞的聚集,活化并促进炎症介质的释放。目前认为,细菌对牙周组织的直接破坏作用是有限的,而由细菌激发的宿主免疫反应是造成牙周组织破坏的主要原因。因此抑制局部免疫反应,抑制该过程中过量的炎症介质产生,能更有效地阻断牙周炎症的发展,从而达到控制牙周病的目的。正常情况下,牙周组织具有自我更新和修复能力,其修复活动主要是通过人牙周膜细胞实现的。牙周膜成纤维细胞是牙周膜中最重要的细胞,它具有分泌和收缩胶原、形成矿化、再生增殖和附着的生物学特性,是牙周组织再生修复的基础,同时也是形成牙周新附着的主要来源。牙周膜成纤维细胞在受到炎症侵袭时,会发生病理性坏死或凋亡,最终导致牙周支持组织丧失,牙齿松动。因此保证一定数目的牙周膜细胞,促使牙周膜细胞有效地在根面附着、增殖和分化,最终达到牙周组织生理和功能性再生,是牙周病治疗的关键。目前在临床上药物治疗作为牙周病治疗中的重要辅助手段,常配合基础治疗使用以提高和巩固疗效。广谱抗生素和化学合成药物具有高效的抑菌和杀菌作用,但长时间大量服用易产生菌群失调、耐药性等不良反应,影响了其在临床上的广泛应用。而中医中药作为中国的传统国粹,以整体观认识牙周病,既注重致病因素对局部病变的影响,也重视宿主反应对局部病变的影响,这也是中医药治疗疾病的优势。中药红芪,为豆科植物多序岩黄芪的干燥根,多年生直立草本植物,具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效。红芪多糖(radix hedysari polysaccharide, HPS)是红芪的主要活性成分之一,主要由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖及葡萄糖等单糖组成。现代药理学研究证明红芪多糖具有调节机体免疫、抗肿瘤、抗炎及抗氧化等作用,是一种具有开发价值的中药新药。本研究旨在探讨红芪多糖对人牙周膜细胞增殖的影响及经LPS刺激的人牙周膜细胞分泌IL-1β和IL-6的影响,初步探索红芪多糖对人牙周膜细胞的作用。第一章人牙周膜细胞的体外分离培养和鉴定目的体外分离培养人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs),观察体外培养的人牙周膜细胞形态特点及其来源鉴定。方法1.取12～25岁因正畸减数拔除的无牙体牙周及全身性疾病患者的健康前磨牙,无菌条件下刮取根中1/3牙周膜组织,组织块酶消化法进行原代培养并传代。取原代及传代培养的hPDLCs,倒置相差显微镜观察其生长形态及特征。2.取对数生长期的第3代细胞,调整细胞浓度至5×104AnL,接种于预置盖玻片的六孔板中,在37℃、5%C02孵箱中培养,待细胞爬满盖玻片时,倾去培养液,PBS浸洗,滤纸条吸干余液,将盖玻片用4%多聚甲醛固定20min。通过免疫组化法进行波形丝蛋白、角蛋白染色,光镜下观察、拍照。3.MTT法检测hPDLCs的细胞活性：取对数生长期的第三代hPDLCs,以1.0×104/孔密度接种于96孔板中,每天取一组在避光条件下加入MTT液20μl,37℃,5%CO2培养箱中继续孵育4h后沿着孔壁小心吸去上清液,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl,摇床上振荡10min,使结晶充分溶解,放置于酶联免疫检测仪上测定各孔的OD值(波长490nm),记录结果。绘制细胞生长曲线,实验重复3次。结果1.组织块酶消化法分离培养的hPDLCs游出率和成活率较高。原代培养5-10d左右可见有细胞从组织块周边游出,高倍镜下观察可见细胞呈长梭形或星形,胞体丰满,胞质均匀,中央有圆形或卵圆形的胞核,核仁清晰可见,为成纤维样细胞。传代后的细胞24h内可贴壁,贴壁后增殖速度快,渐伸展为不规则圆形、多角形、梭形,且呈放射状增殖。2.免疫组化结果显示：波形丝蛋白染色呈阳性,角蛋白染色呈阴性,表明培养的细胞来源于间叶组织。3. hPDLCs接种1-2d时细胞增长缓慢,3d后增殖迅速,7d到达平台期,符合成纤维细胞生长规律。第二章红芪多糖对体外培养人牙周膜细胞增殖能力的影响目的研究红芪多糖对牙周膜细胞增殖的影响,筛选出合适的作用浓度,为后续实验研究做基础。方法1.人牙周膜细胞的培养：同第一章。2.取对数生长期的第4代hPDLCs,以1.0×104/孔密度接种于96孔板中,在37℃、5%CO2孵箱中过夜。待细胞贴壁后,弃去原有培养液,分别加入0μg/mL0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL红芪多糖溶液,同时设立无细胞的空白对照组,分别在加样1d、3d、5d后,采用MTT法观察正常培养下的人牙周膜细胞经不同浓度红芪多糖处理后细胞的增殖情况。3.统计学分析：所得数据用SPSS20.0软件进行单因素方差分析,检验水准a=mL。进行方差分析前,先行方差齐性检验。对方差齐性资料采用LSD法进行多重比较,方差不齐的资料用Dunnett T3法进行多重比较。结果不同浓度的红芪多糖作用细胞1d时,无促进体外培养的人牙周膜细胞增殖的作用(P>0.05)。3d和5d时,0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL能够增强人牙周膜细胞增殖活力,其中在浓度为10gg/mL时作用最强,并与对照组具有显著性的差异(P<0.05),高浓度100gg/mL(F组)时细胞增殖能力减弱。第三章红芪多糖对LPS作用牙周膜细胞分泌IL-1β、IL-6的影响目的观察红芪多糖对经大肠杆菌脂多糖刺激的hPDLCs分泌IL-1β、IL-6的影响,探索红芪多糖对脂多糖激发的牙周炎症免疫过程的影响。方法1.人牙周膜细胞的培养：同第一章。2.取对数生长期的第4代hPDLCs,1×106个/mL接种于6孔板中,培养24 h至贴壁,随机分为空白对照组、LPS组、LPS+红芪多糖组。空白对照组不加任何刺激；LPS组加入10μg/mL-LPS; LPS+红芪多糖组在加入LPS前2h,加入10μg/mL的红芪多糖。以加入LPS开始计算时间,于24 h后,用TRIzol法提取各组总RNA。以各组总RNA为模板,分别逆转录成cDNA,进行荧光实时定量PCR反应,检测各组IL-1β、IL-6 mRNA水平表达。3.取对数生长期的第4代hPDLCs,1×105个/mL接种于24孔板中,培养24 h至贴壁,随机分成空白对照组、LPS组、LPS±红芪多糖组。空白对照组不加任何刺激；LPS组加入10μg/mL Ecoli-LPS; LPS+红芪多糖组在加入LPS前2h,加入10gg/mL的红芪多糖。以加入LPS开始计算时间,于24h后运用ELISA法,检测所测定细胞条件培养液中的IL-1β、IL-6水平。4.统计学分析所得数据用SPSS20.0软件进行单因素方差分析,检验水准a=0.05。进行方差分析前,先行方差齐性检验。对方差齐性资料采用LSD法进行多重比较,方差不齐的资料用Dunnett T3法进行多重比较。结果qRT-PCR检测结果显示10μg/mL LPS单独作用牙周膜细胞24h后IL-1β、IL-6 mRNA的表达量均明显增加,但在预先加入10μg/mL红芪多糖处理后,IL-1p、IL-6 mRNA的表达均有显著降低(P<0.01)。ELISA的检测结果与qRT-PCR结果相一致,10μg/mL LPS单独作用牙周膜细胞24h后,细胞培养液中的IL-1β、IL-6的分泌显著增加,但在加入10μg/mL红芪多糖后,IL-1β、IL-6分泌量下降(P<0.01)。结论1.组织块酶消化法培养人牙周膜细胞的成活率高,在多代培养后仍可以保持良好的细胞活性和增殖能力。根据取材部位和细胞形态,结合免疫组化结果,说明培养的hPDLCs为间叶组织来源。2. 10μg/mL的红芪多糖对人牙周膜细胞增殖具有促进作用,高浓度(100μg/mL)红芪多糖无促增殖作用。3. 10μg/mL的红芪多糖可以下调LPS激发的人牙周膜细胞IL-1p和IL-6的表达,提示红芪多糖可能在对LPS激发的炎症免疫反应有一定的影响。