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豆科植物与根瘤菌的共生固氮在生态环境以及农业生产方面都有着非常重要的意义。最近研究表明苜蓿根瘤的衰老伴随着一个保守的半胱氨酸蛋白酶(Cyps)家族的表达，这类半胱氨酸蛋白酶可能涉及到共生体结构的降解，但是目前没有直接的证据证明这个观点。 为了研究这一机制，本论文以百脉根（Lotus japonicus）中的半胱氨酸蛋白酶基因为研究对象，通过序列比对、同源性分析、启动子分析和遗传转化等方法研究了该基因家族的结构、表达模式和生理功能，重点阐述了LjCyp5基因沉默掉后在根瘤中的表型。取得的主要结果如下： 1.通过同源比对找到了2个百脉根中的半胱氨酸蛋白酶即LjCyp1（Cysteine protease1）和LjCyp5（Cysteine protease5）可能与根瘤的衰老相关。LjCyp1和LjCyp5基因编码的半胱氨酸蛋白酶同源性高达95％，都含有一个假定液泡定位信号肽LQDA可能与其蛋白定位有关，其推测的蛋白质编码序列有1029个碱基，可编码342个氨基酸。 2.本论文然后通过克隆这两个基因2.0kb的启动子（promoter）与报告基因GUS融合，利用毛根转化体系，将载体转入豆科植物百脉根的根中，进行组织化学定位分析。结果表明Cyp1pro报告基因GUS在接种后7天的根瘤原基中少量表达，14天、21天和30天的根瘤中有大量表达，而在50天、70天、80天和90天的成熟和衰老根瘤中基本没有表达，这说明该基因可能为早期结瘤素基因。与之不同的是Cyp5pro报告基因GUS在接种后7天、14天、21天都没有在根瘤中表达，而30天、50天、70天、80天和90天都有超过80%的根瘤中都表达。这说明该基因为晚期结瘤素基因。 3.本论文通过Real-Time PCR分析LjCyp1和LjCyp5基因在百脉根的根、茎、叶、瘤中的表达情况。结果表明，LjCyp1在早期接种和未接种的根中都有表达，接种后表达量高于未接种的根，在根茎叶瘤中也有表达。而LjCyp5基因在接种与未接种根，茎，叶中都没有表达或者表达量很低，但是在接种30天后的根瘤中开始表达，50天、60天的根瘤中大量表达，100天的根瘤中表达减少，说明该基因是一个根瘤特异表达的基因而且表达量与根瘤的年龄相关，随着根瘤年龄的增大表达量也增加。 4.同时本论文根据预测的LjCyp5基因结构，设计特异的RNAi（RNA干扰）片段，构建RNAi载体并将其通过毛根转化转入豆科植物百脉根中，通过GUS鉴定得到阳性植株后，将阳性植株种在沙和蛭石1:1混合盆栽中，接种根瘤菌。结果表明RNAi的转基因植株固氮酶活明显上升，根瘤变大，根瘤延迟衰老，植株生长旺盛。通过石蜡切片分析内部结构、TUNEL细胞凋亡检测及电镜分析超微结构，结果表明敲掉LjCyp5基因后可延迟根瘤的衰老。 5.最后为了更进一步确定该蛋白在根瘤衰老中的功能以及确定定位信号肽的作用，从而将其全长和去掉定位信号肽的活性区域与报告基因GFP融合，通过农杆菌侵染洋葱表皮和转化百脉根毛根来研究该蛋白的亚细胞定位。结果表明，在洋葱表皮细胞中LjCyp5基因编码的蛋白定位于细胞膜和核膜中，在毛根转化的阳性根瘤中该蛋白定位于细胞的膜系统上，具体是否定位在共生体膜还需要更进一步的研究。 以上结果充分证明了LjCyp5基因是一个根瘤特异的半胱氨酸蛋白酶基因，将其RNAi后能够延迟根瘤衰老，植株生长更加茂盛。豆科植物通过根瘤共生固氮来增加土壤的肥力，但是根瘤的寿命一般都较短，因此增加根瘤的有效固氮时间，延缓衰老对于农业生产上有重大意义。本论文正是通过RNAi沉默技术抑制了半胱氨酸蛋白酶基因LjCyp5的表达，从而延迟了根瘤的衰老，延长了根瘤有效固氮时间，使得根瘤变大，固氮酶活增加，植株生长更加健壮，这在豆科作物农业生产上具有一定的应用前景。