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层黏连蛋白受体(37kD laminin receptor precursor/67kD laminin receptor,37LRP/67LR)存在于动物组织的上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、巨噬细胞及大部分肿瘤细胞的表面。37LRP/67LR作为一个多功能蛋白,与多种类型疾病及其进程密切相关,因而引起了人们对它的巨大关注。研究表明,层黏蛋白受体在细胞增殖、分化、迁移、粘附、胚胎发育、神经生长以及肿瘤发生、癌变与转移等方面发挥着重要作用。
本研究应用细胞杂交瘤技术制备37LRP/67LR的单克隆抗体,进而探讨基于此抗体的ELISA检测方法和免疫组织化学方法并进行初步应用。研究内容包括以下4方面:
1 37LRP/67LR单克隆抗体的制备
利用已测得的大鼠层黏连蛋白受体基因序列指导合成多肽-血蓝蛋白化合物(KFLAAGTHLGGTNLD)并将其作为合成抗原,与等量弗氏完全佐剂乳化后,腹腔接种6周龄的雄性BALB/c小鼠;每隔2周用等量弗氏不完全佐剂乳化,加强免疫2次,测得血清效价达到1∶10000以上,后制备其脾细胞;以PEG1500为缩合剂将脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,融合率56.6％,在HAT选择培养液中培养,得到杂交瘤细胞14孔。经筛选亚克隆及扩增等步骤获得能稳定分泌37LRP/67LR单抗的杂交瘤细胞2株,分别命名为aLR-1和aLR-2。体外连续培养2个月以上或经冷冻复苏后,细胞生长良好,并稳定分泌特异性抗体。通过鼠体内诱生法制备抗体,经辛酸-硫酸铵法纯化后经SDS-PAGE电泳,得到55kD和25kD两条带,与IgG重链和轻链的大小吻合,该抗体经单克隆抗体亚型鉴定为IgG2a。
2 夹心ELISA方法的建立和对大鼠脏器的检测
将制备的37LRP/67LR单克隆抗体包被ELISA板,通过确定抗体最佳包被浓度和最佳酶标抗体浓度等条件,初步建立了37LRP/67LR抗体包被的双抗夹心ELISA法。对不同日龄SD大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑和骨骼肌等脏器的组织匀浆进行检测,发现各脏器均有阳性信号,其中,脑和肾脏中含量最高,肺脏和心脏次之,脾脏、肝脏和肠道较低。
3 免疫组织化学方法的建立和应用
建立SP法并对SD大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、小脑、消化道等脏器进行37LRP/67LR单抗免疫组化定位,发现37LRP/67LR在SD大鼠上述脏器有多量阳性细胞分布。其中在消化道中以食管复层扁平上皮、胃底腺、十二指肠绒毛、小肠纹状缘、绒毛根部小肠腺和十二指肠腺等部位呈强阳性。消化道固有层结缔组织呈阴性,黏膜肌和肌层呈中等阳性反应。肝细胞、胰腺腺泡和心肌细胞呈弱阳性。肾脏远曲小管呈强阳性,近曲小管呈弱阳性。大脑皮质神经元呈强阳性,海马神经元呈中等阳性,齿状回神经细胞呈中等阳性反应,脑室膜呈阳性,脉络丛呈中等阳性反应。背侧丘脑等深部主要核团细胞也可见阳性反应,但阳性反应相对较弱。小脑分子层和颗粒层阳性反应较弱,而小脑普金野氏细胞呈中等强度阳性反应。
4 犬肿瘤中37LRP/67LR免疫组织化学观察
采用SP免疫组织化学的方法对犬的淋巴肉瘤、脂肪瘤、乳腺癌、牙龈瘤等肿瘤病例进行观察。犬淋巴肉瘤中,肿瘤细胞染色呈阴性反应,肿瘤间质细胞也呈阴性反应。犬脂肪瘤细胞染色呈中等阳性,脂肪含量较少的细胞染色阳性相对强烈。犬乳腺癌增生团块周边残存的肌上皮细胞呈中等到弱阳性显色,癌细胞呈强阳性反应。牙龈瘤中单核巨噬细胞呈阳性,分布于细胞浆内。增生纤维组织呈阴性。37LRP/67LR免疫组织化学反应在犬不同肿瘤组织中具有良好的差异性,提示37LRP/67LR免疫组织化学在犬肿瘤病的检测与诊断具有较好的研究价值和潜在应用价值。