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植物病毒病害,防治上十分困难。植物病毒侵入寄主植物后,病毒粒子能够抑制植物中参与生长及形态建成相关基因的表达,从而对植物造成严重的损伤。在这一过程中,病毒侵染可迅速启动植物的抗逆反应。本文从烟草NtWRKY40转录因子和amiRNA(artificial micro RNA,amiRNA)两个方面,研究了NtWRKY40在烟草防御烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染过程中的作用,应用amiRNA技术抑制病毒表达以及反义寡核苷酸反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide,asODN)在筛选抗病毒amiRNA成熟序列中的作用。近年来,利用人工miRNA防治植物病毒病的技术研究,已经取得许多重要成果。人工miRNA技术主要是利用天然miRNA能够降解目标靶基因的特性,以改变其成熟序列,构建出能够沉默目的基因的小RNA。这种技术以其特异性、高效性受到了普遍的关注,在动植物代谢工程、生长发育调控以及抵抗外源病毒等方面起着重要的作用。反义寡核苷酸(asODN)对靶标序列的识别具有特异性与专一性,近年来被广泛应用于基因功能的分析。asODN技术对基因的表达具有抑制作用,因此,我们希望将asODN技术拓展到对amiRNA成熟序列的筛选应用中,尤其是对抗病毒amiRNA的筛选。如果可行,将会推进现代生物技术的发展与应用。本研究结合已有的报道及生物信息学分析,我们发现病毒侵染烟草后会诱导NtWRKY40基因高表达。为确定该基因功能,本研究将NtWRKY40基因连接到植物双元表达载体pBI121上,通过农杆菌介导转化烟草,获得35S::NtWRKY40转基因植株,以探究NtWRKY40对病毒侵染的响应。实验中经过筛选共获得NtWRKY40过表达植株的7个株系,即W1~W7。此外,本实验以马铃薯Y型病毒(Potato virus Y,PVY)为实验材料,以其外壳蛋白基因(PVY-CP)为靶基因,以烟草天然miR167e为骨架,通过重叠PCR获得amiR167-PVY片段,将其连接到植物双元表达载体pBI121上。通过农杆菌介导转化烟草,获得35S::amiR167-PVY转基因植株,预期培育出抗马铃薯Y型病毒的植株,以实现对植物病毒病的自动应答。实验共培养获得转基因植株的三个株系,即PVY-1、PVY-2和PVY-3。结果显示:野生烟草在病毒侵染后9 d,Nt WRKY40的表达量显著升高,而NtWRKY40过表达的转基因烟草在病毒侵染后,病毒相关基因的表达高于野生型对照,且与染病程度成正相关,这说明过表达NtWRKY40增加了植株对病毒的敏感性,该基因是一个负调控因子。结果还显示:PVY病毒接种前,与野生烟草相比,三个株系的前体序列的表达水平有明显的提高,且其成熟序列与前体基因(pre-amiRNA)的表达水平呈正相关。PVY病毒接种后,PVY-CP基因的表达水平与amiRNA成熟序列的表达水平表现出负相关,并且在转基因植株中的发病率比野生型低,病症也发展较慢,说明amiRNA抑制了病毒基因的表达,起到了一定的抗病毒作用。以上结果表明,本研究所构建的amiRNA对PVY病毒有一定的抑制作用,但是并不能完全抑制病毒。因此,对于获取病毒高抗性植株来讲,我们选择设计的amiRNA序列并不是最佳的抗病毒序列。用于基因沉默的最佳amiRNA不能仅从序列上来判断,还需寻找更好的方法筛选amiRNA序列。本研究还基于TMV外壳蛋白序列,通过Soligo软件预测出asODN-TMV链,在进行抗TMV病毒实验时,我们拟确定出asODN-3链对病毒的瞬时抑制效果稍好。在本研究中,初次表明asODN对病毒基因的表达有作用,但还需对实验方法进行优化,以建立更好的asODN抗病毒体系,使得asODN在寻找抗病毒amiRNA最佳靶序列中发挥重要作用。综上结果,为进一步研究amiRNA介导病毒抗性的产生机制,asODN在筛选抗病毒amiRNA,以及利用该策略培育多抗病毒转基因植物提供依据。