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普遍认为两栖动物皮肤功能基因组具有多态性丰富、随环境变化而快速重组突变的特征，造成这种分子多态性和复杂性的显著差异的因素，最合理的解释就是环境，尤其是环境微生物的驱动，然而此理论还缺乏足够的研究证据。已有研究表明，不同产地或不同时间点的无指盘臭蛙皮肤抗菌肽种类和数量多变，而抗菌肽为两栖动物先天免疫系统的主要成分，也是皮肤分泌物中的主要多肽。因此，研究无指盘臭蛙皮肤的先天免疫（首先是分泌物，然后是抗菌肽）的动态变化及与环境因子，特别是环境细菌的关系，有可能解决两栖动物皮肤功能基因组受环境，尤其环境细菌驱动的问题。本文首先以景东臭蛙为对象，分离纯化皮肤抗菌肽并鉴定一级结构，从而建立以串联质谱从头测序技术为核心的两栖动物皮肤分泌活性多肽的研究技术体系，克服两栖动物皮肤功能基因组受环境驱动问题的研究在抗菌肽层次的主要技术瓶颈;然后以无指盘臭蛙为研究对象，从分泌物的层次研究了不同地点或同一地点不同时间点的动物先天免疫的动态变化;最后利用建立的技术体系进行了无指盘臭蛙皮肤分泌物中动态变化抗菌肽的初步研究。 ㈠景东臭蛙皮肤抗菌肽的分离纯化、鉴定及活性研究。以景东臭蛙为对象，分离纯化皮肤抗菌肽、鉴定序列并验证活性，研究结果：⑴发现了8个抗菌肽，其中两对具有相同的理论分子量且难于被HPLC分离。⑵Brevinin-1JDa和Nigrocin-2JDa为首次在天然蛋白水平被确认，Brevinin-1JDc为新肽，且二硫环内序列CLISKKC为首次在抗菌肽中被发现。⑶在4个抗菌肽的二级质谱中观察到了罕见的低能量、阳离子模式下的分子内二硫环内断裂现象，且首次阐明了其完整裂解途径为:C端肽键按照环肽断裂模式依次断裂，然后在C-S键上发生次级剪切，此类断裂的标志离子为[MH-28]+;此发现说明二硫环内断裂现象在含C端二硫环的肽中可能并不罕见，此机理的提出为Top-down测序直接鉴别二硫环内序列提供了可能，也能被用于二硫键定位。⑷杀菌动力学研究结果揭示了发现的部分抗菌肽，其作用机理可能不同于经典的膜破坏机理。 ㈡串联质谱从头测序技术体系的组成与关键点。通过以上实践研究，建立起串联质谱从头测序技术体系，其组成与关键点归纳如下：⑴碰撞能量从低到高缓慢上升直到离子完全碎裂;挑选碎裂合适的同一能量下的连续谱图平均化。⑵高于1800 Da，尤其高于3000 Da的质量峰，根据理论同位素模式进行手工调整。⑶容差设定为±0.0180 Da且±20 ppm，初步分配准同质的赖氨酸和谷氨酰胺;由相邻的阶梯离子相减所得出的残基质量来进一步确定赖氨酸和谷氨酰胺;根据互替后的精确分子量是否落在理论误差值外最终确定赖氨酸和谷氨酰胺。⑷含蛙盒结构多肽，烷基化前质谱如出现强度较高的[MH-28]+离子，应按照环肽断裂模式为主，C-S键断裂模式为辅进行环内序列分配。 ㈢无指盘臭蛙皮肤先天免疫的时空动态。选取无指盘臭蛙在云南昆明、四川会理及四川冕宁的3个居群进行研究。昆明和会理居群，每个居群分别采集三个时间点（2009年5月、7月和9月）的动物样品，冕宁居群采集四个时间点（2009年9月，2010年5月、7月和9月）的动物样品。采集动物的同时采集动物栖息地的土样和水样，收集小生境的环境因子;对无指盘臭蛙不同种群或同一种群不同时间点的栖息地环境细菌计数，利用细菌16S rRNA基因序列分析技术鉴定环境优势细菌;收集各批次动物的皮肤分泌物，并检测这些分泌物对69株环境优势细菌及5株标准微生物的最小抑菌浓度;获得动物体重、体表面积、分泌物重量、环境细菌数、优势细菌丰度等数据。综合上述数据，再加入一些2007-2008年前期研究的数据，经统计分析，建立无指盘臭蛙体重体表面积关系公式;分析了动物采样时所处小生境的细菌及环境因子的变化;探讨了不同居群，以及不同时间（季节）的动物皮肤所含有的分泌物的MIC值及动物抗菌能力的时空动态及关系。分析结果表明：⑴测试的菌株中有多株细菌对应的各取样批次分泌物的MIC值同时与分泌物-体重比，土细菌数的对数或水优势菌比例显著相关。⑵不同取样批次动物的分泌物针对不同的菌株，其MIC值的变化在多数情况下具有接近的趋势;而不同取样批次的动物对不同的菌株，其抗菌能力的变化也具有同样的趋势。⑶时间和空间并不是影响无指盘臭蛙皮肤分泌物的MIC值变化的主要因素。⑷无指盘臭蛙皮肤抗菌肽Brevinin-1E-OG7呈现高度动态变化，但无时空变化规律。