【摘 要】
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红松（Pinus koraiensis）体细胞胚胎发生过程中发现,随着长期继代培养胚性愈伤组织的体胚发生能力会逐渐下降,这一现象严重影响体胚发生技术的大规模应用。因此,本试验尝试通过调节胚性愈伤组织增殖培养过程中培养基的激素配比、碳源类型,培养的继代周期和玻璃化法超低温保存来保持其体胚发生能力,测定不同处理的生理代谢差异,揭示胚性愈伤组织体胚发生能力丧失的原因和调控机理,进而保持其胚性愈伤组织的体
【基金项目】
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林木遗传育种国家重点实验室（东北林业大学）创新项目“珍贵乡土树种红松体胚发生潜力差异的生物学机理”（2021B01）; 国家重点研发计划重点专项“林业资源培育及高效利用技术创新”的项目“北方主要珍贵用材树种高效培育技术研究”（2017YFD0600600）
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红松（Pinus koraiensis）体细胞胚胎发生过程中发现,随着长期继代培养胚性愈伤组织的体胚发生能力会逐渐下降,这一现象严重影响体胚发生技术的大规模应用。因此,本试验尝试通过调节胚性愈伤组织增殖培养过程中培养基的激素配比、碳源类型,培养的继代周期和玻璃化法超低温保存来保持其体胚发生能力,测定不同处理的生理代谢差异,揭示胚性愈伤组织体胚发生能力丧失的原因和调控机理,进而保持其胚性愈伤组织的体胚发生能力。主要结果如下:（1）继代周期显著影响胚性愈伤组织的生理代谢。继代培养周期为7 d的处理更适合胚性愈伤组织的长期继代培养。继代第8个月后继代培养周期为7 d的处理胚性愈伤组织IAA含量、SOD活性、CAT活性均高于继代培养周期为14 d的处理,而H2O2含量却呈相反趋势。在整个胚性愈伤组织继代培养过程中,继代培养周期为7 d的处理胚性愈伤组织的可溶性糖和淀粉含量均高于继代培养周期为14 d的处理。（2）激素配比显著影响胚性愈伤组织的生理代谢。1 mg·L-1NAA+0.25 mg·L-16-BA的处理更适合胚性愈伤组织长期保持。继代12个月后胚性愈伤组织的ABA含量(363ng·g-1)和IAA(35.53 ng·g-1)含量高度积累。同时继代第8个月后1 mg·L-1NAA+0.25mg·L-16-BA的处理SOD活性均高于2 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16-BA的处理。（3）碳源显著影响胚性愈伤组织的生理代谢。相较于蔗糖处理,以麦芽糖为碳源的处理更适宜红松胚性愈伤组织的长期继代培养和体胚发生潜力的保持。随着继代培养时间的延长麦芽糖为碳源的处理相较于蔗糖为碳源的处理胚性愈伤组织具有较高的ABA/IAA比、储藏物质含量、SOD活性和CAT活性。（4）玻璃化超低温保存方法可用于红松胚性愈伤组织的胚性保持。最佳保存方式为:0.5 mol.L-1蔗糖培养基上预培养2 d,2PVS2阶段脱水40 min,PVS2阶段脱水40min,40℃温水浴中化冻,化冻后细胞存活率最高为47.81%。在此过程中,可溶性糖含量在预培养和复苏阶段达到最大值(16.01 mg·mg-1prot和8.32 mg·mg-1prot),淀粉含量在脱水阶段达到最大值(2.96 mg·mg-1prot)。可溶性蛋白在预培养阶段蛋白质含量下降。丙二醛冷冻阶段达到最大值(105.83 nmol·mg-1prot)。综上所述,本研究发现继代培养周期为7 d,激素配比为1 mg·L-1NAA+0.25 mg·L-16-BA,碳源为麦芽糖时,能够长期保持胚性愈伤组织的体胚发生能力。同时还发现储藏物质对红松体胚提供了能量来源,高水平的IAA、SOD、CAT和低水平的H2O2利于胚性愈伤组织的体胚发生。此外,利用玻璃化超低温保存方法可以长期保存胚性愈伤组织的体胚发生能力。这些结果进一步揭示了红松胚性愈伤组织体胚发生能力丧失的生理机理,从而达到长期保持红松胚性愈伤组织体胚发生能力的目的。
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