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目的浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)是著名的“浙八味”之一,是我省重要的经济作物。由于长期无性繁殖和连年种植,浙贝母真菌性病害日益突出,而盲目、过度、重复用药造成农药残留、环境污染、病原微生物的抗药性等问题,严重制约了浙贝母产业的可持续发展。为此,本项目分离和鉴定了浙贝母病原真菌的主要种类,并进一步制备针对浙贝母主要病原真菌的单克隆抗体(简称单抗),为开发基于该单抗的胶体金免疫层析试纸条奠定基础。在此基础上,通过测定病原真菌对几种常见杀菌剂的敏感性,为合理选择杀菌剂防治浙贝母病害提供科学依据,为提高浙贝母的产量和品质提供技术支撑。方法(1)从浙江省磐安县采集浙贝母病株,采用植物病组织分离法分离纯化病原真菌,通过对菌落、菌丝体和孢子形态特征的观察,初步鉴定病原真菌种类。采用病原真菌接种试验确定其致病性。再提取病原真菌的DNA,经PCR扩增其核糖体内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)和翻译延伸因子基因(Translation Elongation Factor 1 Alpha,TEF-1α)的部分片段,最后采用DNA条形码技术进一步明确病原真菌的分类地位。(2)以病原真菌菌丝体和孢子的混合物作为抗原免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备分泌针对病原真菌的单克隆抗体的细胞株。采用间接ELISA和Western blot分析单抗的效价、特异性、灵敏度、抗体类型及蛋白结合位点等特性。(3)通过抑菌圈法和生长速率法测定病原真菌对3种杀菌剂(咪鲜胺、苯醚甲环唑、戊唑醇)的敏感性。结果(1)从浙贝母黑斑病、干腐病和叶斑病的病株中分离纯化得到4株病原真菌。经寄主植物接种实验确定分离物1为黑斑病病原菌,分离物2和分离物3为干腐病病原菌,分离物4为叶斑病病原菌。分离物1菌落毛毡状,初期为灰白色,后渐变为青褐色至黑褐色;分生孢子单生或短链生,黑褐色,大多为倒棍棒形,有纵横隔膜,短喙或无喙;ITS序列和TEF-1α序列与链格孢菌(Alternaria alternata)的同源性为100%。分离物2菌落为规则的圆形,正面白色,背面紫色;大型分生孢子镰刀形,1～4个分隔,数量较少,多为小型分生孢子,椭圆形或腊肠形,有0～1个分隔,单生或假头状着生;ITS序列和TEF-1α序列与尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的同源性为100%。分离物3菌落初期白色,后期浅驼色,大型分生孢子较多,为镰刀型或直筒型,有3～6个分隔;厚垣孢子为褐色球形,串生于菌丝中间,单瓶梗和复瓶梗产孢;ITS序列和TEF-1α序列与半裸镰刀菌(Fusariumincarnatum)的同源性为100%。分离物4在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上培养菌落为圆形,菌落中央稍隆起,淡红色,外圈为灰白色;在燕麦培养基(OA)上菌落初期为白色,后期中央淡绿色,边缘红色,基质变红;ITS序列与一种茎点霉属真菌(Phoma sp.Anhui-Rfsb04,登录号为KX219595)的同源性为100%,TEF-1 α序列与另一种茎点霉属真菌(P.fungicola strain 7F90,登录号为KC357259)的同源性为86%。(2)制备了 2株能稳定分泌针对镰刀菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为14A9和5B6,其抗体类型分别为IgM和IgG1,腹水型单抗经间接ELISA检测效价分别为1.311×107和4.096×105,14A9对半裸镰刀菌的灵敏度为0.125 μg/mL,5B6对尖孢镰刀菌的灵敏度为0.0625 μg/mL,14A9与层生镰刀菌(F.proliferatum)、砖红镰刀菌(F.lateritium)、甘蔗镰孢霉(F.sacchari)、木贼镰刀菌(F.equiseti)、半裸镰刀菌、尖孢镰刀菌等6种镰刀菌均有交叉反应,但与链格孢菌、茎点霉菌无交叉反应,5B6则只与本实验分离获得的尖孢镰刀菌和半裸镰刀菌反应。Western blot结果表明,14A9与半裸镰刀菌分子量约为51 kDa和37 kDa的蛋白条带结合,5B6与尖孢镰刀菌分子量约为37kDa和39kDa的蛋白条带结合。(3)抑菌圈法测定结果表明,咪鲜胺对尖孢镰刀菌、半裸镰刀菌、链格孢菌的抑制效果最好。生长速率法测定结果表明,咪鲜胺对尖孢镰刀菌、半裸镰刀菌、茎点霉菌的抑制作用最好,其EC50分别为0.001 mg/L、0.042 mg/L、0.124 mg/L。3种杀菌剂对链格孢菌的毒力大小依次为苯醚甲环唑>咪鲜胺>戊唑醇,其中苯醚甲环唑的EC50为0.016 mg/L。结论(1)从浙贝母病株中分离获得4种病原真菌,明确了链格孢菌为浙贝母黑斑病病原菌,尖孢镰刀菌和半裸镰刀菌为浙贝母干腐病病原菌,茎点霉属真菌为浙贝母叶斑病病原菌。其中,首次在浙贝母病株上分离获得半裸镰刀菌和茎点霉属真菌。(2)制备了 2株能稳定分泌针对镰刀菌的单抗的杂交瘤细胞株,其中5B6的特异性较好。(3)咪鲜胺对尖孢镰刀菌、半裸镰刀菌、茎点霉菌均具有较强的抑制作用,苯醚甲环唑对链格孢菌的抑制能力最强。