论文部分内容阅读
从前列腺癌中发现的copine-8蛋白(基因名CPNE8)是copines蛋白家族的成员之一。Copines蛋白家族是一类Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,该蛋白家族成员在多种生物中都表达,并且各成员之间具有较高的同源性。Copines蛋白家族具有共同的结构特性:两个结构相似的C2结构域和一个血友病因子结构域(von Willebrand factor A),简称A结构域(vWA)。本研究初步探索copine-8蛋白对肿瘤细胞生长和迁移的影响及其在细胞中的定位,并制备了copine-8蛋白多克隆抗体,为深入探究copine-8蛋白的生物学功能奠定基础。本实验首先培养人子宫颈癌Hela细胞,从Hela细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得CPNE8基因。利用限制性内切酶酶切真核表达载体pEGFP-N1、原核表达载体pGEX-4T-1以及CPNE8基因,用T4连接酶构建重组质粒并验证。将经验证正确的真核表达载体pEGFP-N1/CPNE8瞬时转染H1299细胞后,通过平板单克隆形成实验检测细胞增殖的差异,并采用transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力的差异。同时,将构建好的真核表达载体pEGFP-N1/CPNE8瞬时转染人源胚胎肾细胞293T,通过激光共聚焦观察,确定copine-8蛋白在293T细胞中的亚定位。运用同样的方法确定copine-8蛋白在肺腺癌细胞H1299中的定位。此外,将经验证正确的原核表达载体pGEX-4T-1/CPNE8转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta(DE3)感受态,诱导表达GST-copine-8融合蛋白,初步确定GST-copine-8融合蛋白的优势表达菌株以及诱导表达的条件。大量诱导表达GST-copine-8融合蛋白,超声破碎菌体获得GST-copine-8包涵体,纯化回收该融合蛋白后注射新西兰大白兔制备多克隆抗体血清并检测。实验最终获得表达人源copine-8蛋白的基因-CPNE8,凝胶电泳显示单一条带。连接、转化、培养后,经抗生素筛选得到的阳性克隆菌落用菌体PCR以及酶切验证,在预期位置有相应的特异性条带;同时,重组质粒送至公司进行DNA序列测定,经BLAST比对,产物序列与GenBank数据库中的CPNE8基因序列一致,表明成功构建重组质粒pEGFP-N1/CPNE8 和 pGEX-4T-1/CPNE8。统计学分析转染重组质粒 pEGFP-N1/CPNE8 的H1299细胞增殖数据,发现瞬时过表达copine-8蛋白的H1299细胞与对照组相比,其细胞数量极显著上升,差异具有统计学意义(P＜0.001)。该结果表明过表达copine-8蛋白能提高H1299细胞体外增殖的能力。统计分析transwell实验中上述细胞的迁移数量差异,发现与对照组相比,瞬时转染pEGFP-N1/CPNE8的H1299细胞穿过transwell小室的细胞数减少,细胞迁移数量极显著减少,差异具有统计学意义(P<0.001)。该结果表明copine-8蛋白能抑制H1299细胞的迁移能力。通过激光共聚焦观察转染pEGFP-N1/CPNE8的293T细胞和H1299细胞,在293T细胞中绿色荧光几乎都分布在细胞膜上,少量分布在细胞质内;在H1299细胞中绿色荧光绝大多数分布在细胞膜上,说明copine-8蛋白定位在肿瘤细胞的细胞膜上。将制备好的copine-8多克隆抗体用间接ELISA法检测,发现其效价可达到1:10000以上。Western blotting结果显示,此多克隆抗体可特异性识别外源表达的copine-8蛋白并可用于免疫组化检测copine-8蛋白在人体不同组织中的分布。