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基因表达调控的研究是分子生物学的一个核心课题。目前的研究主要集中在基因序列本身相关的启动子和3’—UTR上,但基因序列本身并不足以完全解释基因表达的调控。近年来有研究表明基因的表达与其在染色体上所处的位置有关,但是尚未有系统的研究。
要系统地开展位置效应的研究,需要在染色体不同位置上插入相同报告基因的一系列突变体。酵母基因敲除计划(Guri G et al.,2002)所得到的酵母敲除菌株充分的满足了本论文的研究需求。该计划用一个相同的报告基因KanMX4 module分别替换了酵母基因组近6000个基因。因此本论文选择该计划产生的50株酿酒酵母1号染色体基因敲除的杂合二倍体BY4743作为实验材料,首次较大规模地开展了酿酒酵母1号染色体基因表达的位置效应的研究,初步探讨了基因的表达与其在染色体上的位置之间的关系。
本文采用多重Taqman探针法real—time qPCR技术作为检测基因表达的手段,建立了三重Taqman探针法real—time qPCR检测基因表达的实验体系。经过预实验充分检测了影响三重real—time qPCR准确性的各种因素,结果表明该实验体系非常好的满足了准确定量的要求。
通过real—time qPCR实验检测报告基因表达量,对表达数据的分析结果如下:
1)利用绝对定量标准曲线分析原基因启动子的表达。结果显示,50个菌株里面只有3个菌株检测到了原基因的表达产物。
2)分析KanMX4 module报告基因的表达。结果显示,在50个基因位置上,KanMX4 module的表达各不相同,但相对均一。
3)分析比较原始启动子与KanMX4 module启动子的强弱。结果表明,只有在原基因表达比KanMX4 module表达明显高的位置上,原基因启动子才参与KanMX4 module的表达。
4)基因表达位置效应的分析。结果显示,KanMX4 module的表达大部分高于原基因的表达水平。将代表位置效应的KanMX4 module的表达与代表基因受各种调控因素综合影响的原基因的表达作相关性分析,结果为R2=0.0363。
5)基因的表达与基因之间的距离相关性弱(R2=0)。
综上所述,我们的研究结果表明,由于KanMX4 module所带的启动子普遍强于原基因的启动子,得到的表达结果比原基因要高,但比较均一;可以看到KanMX4 module在染色体的不同位置时存在位置效应,但是效应比较弱;位置效应的分析结果表明,在基因表达的调控因素里面,基因的表达与位置并没有显著的相关性。