【摘 要】
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4-香豆酸-辅酶A连接酶是木质素生物合成途径中的一个重要限速酶.本研究通过对毛白杨中的4-香豆酸:辅酶A连接酶(Pto4CL1)蛋白第338位缬氨酸进行缺失突变,从而获得了具有芥子酸
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4-香豆酸-辅酶A连接酶是木质素生物合成途径中的一个重要限速酶.本研究通过对毛白杨中的4-香豆酸:辅酶A连接酶(Pto4CL1)蛋白第338位缬氨酸进行缺失突变,从而获得了具有芥子酸催化活性的Pto4CL1蛋白突变体338dVa1.与野生型4CL1蛋白活性相比较,该突变体获得了催化芥子酸的活性,比活力是1.62±0.34nkat/mg.同时,对4-香豆酸催化活性有轻微的降低(约降低12％),对咖啡酸的催化活性有明显增加(约增加126％),对阿魏酸的催化活性有部分的降低(约降低29％),对肉桂酸的催化活性没有显著变化.该结论证实了338位缬氨酸对底物芥子酸5位甲氧基具有空间位阻效应.该项研究为了解受Pto4CL1调控的植物次生代谢网络或途径提供了必要的信息和可能的基因工程方法.
毛白杨4CL1是包括536个氨基酸残基并且分为N端和C端两个结构域.通过对重组Pto4CL蛋白稳定性的改良,克服了重组Pto4CL蛋白严重的降解行为,最终找到了适合该蛋白晶体生长的条件,获得了有衍射的Pto4CL针状晶体.这是4CL家族第一个蛋白结晶.并通过把Pto4CL和底物4-香豆酸共结晶,成功得到了晶形完全不同的有衍射立方体晶体,对Pto4CL和其复合物晶体的结构解析将最终揭开4CL的底物选择特异性机制.
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