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脑胶质瘤是最为常见的中枢神经系统原发肿瘤,据统计我困脑胶质瘤占颅内肿瘤的35.2％-61.0％,平均49.7％。化学治疗作为胶质瘤治疗的重要补充,其地位已经明确并得到肯定。
交叉反应物质197(cross-reacting materia1197,CRM197)是白喉毒素突变体中的一种,丧失毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性,它们均可以与细胞膜上的白喉毒素受体(diphtheria toxin receptor,DTR),也称肝素结合表皮生长因子的膜结合前体(pro heparin-binding epidermal growth factor,pro HB-EGF)结合。本实验室前期研究证实DTR在人脑胶质瘤中表达,且其表达水平与胶质瘤病理级别呈显著正相关关系。从20世纪80年代中期起,CRM197就作为载体蛋白应用于人类疫苗的接种。最近研究发现,CRM197能够作为转运载体,转运大分子的辣根过氧化物酶通过血脑屏障(blood brain barrier,BBB),目前认为其机制主要是CRM197与DTR结合后,通过受体介导的胞吞转运通过BBB。研究证实,CRM197具有抗肿瘤作用,但CRM197对胶质瘤的作用尚未见报道,其与传统化疗药物联合应用可能成为胶质瘤治疗的新途径。
P13K/Akt信号通路在肿瘤的增殖、凋亡、血管发生以及细胞运动中发挥着重要作用。P13K/Akt信号通路被激活,抵抗细胞凋亡,促进肿瘤生长。顺铂是治疗胶质瘤的常用化疗药物,但易产生耐药性,限制了其在临床上的应用。实验研究证明,顺铂作用于肿瘤细胞,可以激活P13K/Akt信号通路,抑制细胞凋亡,而CRM197可以抑制P13K/Akt信号通路的激活。CRM197和顺铂联合应用,CRM197是否可以通过抑制顺铂引起的P13K/Akt信号通路的激活,提高胶质瘤对顺铂的敏感性而提高化疗效果,为治疗脑胶质瘤提供新途径足本实验的研究宗旨。
材料和方法：
一、实验材料
(一)实验细胞株U251胶质瘤细胞株由中国医科大学细胞生物重点实验室提供。
(二)主要试剂CRM197,顺铂,MTT,DMSO,LY294002,Wortmannin(美国Sigma公司),DMEM/F-12培养基(美国HyClone公司);胎牛血清(天津灏洋生物科技有限公司);AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒,细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒(南京凯基生物科技有限公司);羊抗Aktl/2多克隆抗体,兔抗p-Aktl/2/3(Ser473)多克隆抗体,小鼠抗β-actin单克隆抗体,增强化学发光法试剂盒(美国Santa Cruz公司);兔抗山羊HRP标记的IgG二抗,山羊抗兔HRP标记的IgG二抗,山羊抗小鼠HRP标记的IgG二抗(北京中山生物技术公司)。
(三)主要仪器细胞培养箱(美国Forma scientific公司);超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);倒置显微镜(同本TMS公司);紫外一可见光分光光度计(日本岛津公司);BDFACSCalibur流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司);超声粉碎机(德国Dr.Hielscher公司);台式低温超速离心机(德国Sigma公司);聚丙烯酰胺凝胶电泳装置(美国Bio-Rad公司);转印仪(北京市六一仪器厂);Las3000成像系统(日本FUJIFILM公司);凝胶成像分析软件(江苏捷达科技有限公司);电子分析天平(德国Sartofius公司);-80℃超低温冰箱(日本SANYO公司);恒温震荡水浴(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)。
二、实验方法：
(一)细胞培养
(二)药物浓度设计及分组1、(1)对照组(2)顺铂(51ug/m1)组(3)CRM197(1ug/m1)组(4)顺铂(51ug/m1)+CRM197(1ug/m1)组
2、(1)对照组(2)LY294002(10um/1)组(3)Wortmannin(1um/1)组(4)顺铂(5ug/m1)+CRM197(1ug/m1)组(5)顺铂(5ugm1)+CRM197(1um/ml)+LY294002(1Oum/1)组(6)顺铂(51ug/m1)+CRM197(1ug/m1)+Wortmannin(1um/1)组
(三)细胞生长抑制实验(MTT比色法)
(四)细胞凋亡Annexin V-FITC/PI检测
(五)细胞凋亡线粒体膜电位检测(JC-1)
(六)Western blot方法检测Akt及p-Akt蛋白的变化
(七)统计学处理所有数值以均数士标准差(X±SD)表示,采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析,组问比较采用单因素方差分析(Bonferroni检验),P
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