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内分泌干扰物的研究(endocrine disruptors,EDs)已经成为全球性的热点和焦点.类雌激素是非常重要的一类内分泌干扰物,而卵黄蛋白原则是重要的外源性雌激素暴露的生物标志物之一,因此卵黄蛋白原的检测也成为研究的热点,酶联免疫吸附试验(ELISA)是最常用且最简便的检测方法之一。鱼类是检测水环境中类雌激素的重要监测生物,已有报道各种多克隆抗血清和单克隆抗体分别应用于不同鱼类的卵黄蛋白原检测,但是这些多克隆抗血清和单克隆抗体具有种属特异性,即只能识别一种鱼类的卵黄蛋白原,不能检测其他鱼类的卵黄蛋白原或检测灵敏度差异较大；此外,多克隆抗血清和单克隆抗体的制备比较耗时并且成本较昂贵,这些问题都造成了现有的卵黄蛋白原检测方法的局限性。
为此,我们利用噬菌体展示技术,建立了鼠源噬菌体展示非免疫单链抗体文库,用以淘选能够识别鲤科鱼类卵黄蛋白原N端高度保守序列的单链抗体。其中单链抗体H4可以识别斑马鱼(Danio rerio)、鲤鱼(Cyprinus carpio)和稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)的纯的卵黄蛋白原,并且具有相似的结合亲合常数(～106/mol),即单链抗体H4能以相同的灵敏度检测这3种鲤科鱼类的卵黄蛋白原。同时,单链抗体H4也可以检测斑马鱼血清样品中的卵黄蛋白原含量,由此建立了一个简单且低成本的ELISA检测鲤科鱼类血清中卵黄蛋白原的新方法。
本论文的另一部分研究内容为单链抗体的定向固定。随着人类全基因组和部分动植物全基因组的测序成功,大量蛋白质组分析需要制备大量的高亲合力的抗体和高通量分析。高通量分析的方法之一就是制备蛋白质芯片并通过生物传感器等检测蛋白质的相互作用。抗体芯片的制备通常需要将高亲合力抗体固定在基质上,这里会遇到的问题有两个,抗体蛋白的纯化和固定后抗体活性的保持。噬菌体展示技术是筛选高亲合力特异性抗体的重要方法之一,单链抗体文库是噬菌体展示抗体文库的主要类型之一。而目前存在的问题是,单链抗体由于分子量小(约28kDa),直接通过非特异性的物理吸附在固相载体上会造成空间构象的改变,失去原有的生物活性。因此,发展一种不影响单链抗体活性的定向固定方法是非常必要的。
我们通过对噬菌粒载体pCAN7AB5E的改造,在单链抗体的C端融合表达double6His—tag,分别构建了噬菌粒载体DH-a和DH-b,并用本实验室已知的单链抗体对载体的性能进行了检验。结果表明噬菌粒载体DH—a和DH-b能够成功的将单链抗体展示于噬菌体表面,所表达的可溶性表达单链抗体能够不经纯化直接定向固定到包被有Ni2+的基质上并保持生物活性。
同时,我们利用噬菌粒载体DH-b建立了鼠源噬菌体展示天然单链抗体文库,库容达1.1×1010。该文库是筛选不同靶分子特异性单链抗体的重要资源,并为可定向固定的单链抗体的筛选提供了一个技术平台,为抗体芯片的制作提供了充足的抗体资源.
利用所构建的噬菌体展示天然单链抗体文库淘选识别斑马鱼卵黄蛋白原的单链抗体,4轮淘选后发现所富集的单链抗体均不能可溶性表达.将这些单链抗体克隆到pET-32a载体并在大肠杆菌ori DE3中获得可溶性表达。其中单链抗体32a—F5及其轻链部分,即单域抗体32a-F5(L),都可识别斑马鱼和鲤鱼的纯的卵黄蛋白原,并且可采用直接ELISA法检测雌性成年斑马鱼血清中的卵黄蛋白原含量.同时,单域抗体32a-F5(L)可定向固定于Ni-NTA HisSorb Plate,并采用间接ELISA法检测雌性成年斑马鱼血清中的卵黄蛋白原含量.此研究发展了一种原核表达可溶性单链抗体的新方法,并建立了一种以单链抗体定向固定为基础的夹心ELISA检测血清样品中斑马鱼卵黄蛋白原的新方法。