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生长素反应因子(ARF)是1997年发现的新一类转录因子家族，它们与生长素早期反应基因启动子中的生长素反应元件TGTCTC特异性地结合，调节这类基因的转录活性。到目前为止，在拟南芥中已发现了23个ARF类基因，以及从水稻的胚芽鞘、番茄果实、马铃薯块茎的顶芽和黄瓜幼苗中鉴定出OsARF1，DR12、ARF6和CsARF等ARF类基因，本实验室根据芒果子叶横切段的近轴面能产生不定根而远轴面不能生根的特点，通过SSH和RACE技术克隆得到两个芒果(Mangifera indica L. cv.Zihua)生长素反应因子基因MiARF1(GenBank登录号：AY255705)和MiARF2(GenBank登录号：AY300808)，它们的氨基酸序列与拟南芥中的AtARF2(GenBank登录号：BAB10162)有非常高的同源性，分别达到60％和84％(肖洁凝等，2004)。
本文主要旨在通过研究芒果MiARF1和MiARF2基因在拟南芥中过量表达所引起的表型变化，揭示这两个生长素反应因子类基因的功能。主要的研究结果如下：
为了在拟南芥中异位表达芒果生长素反应因子类基因MiARF1和MiARF2，我们将MiARF1和MiARF2基因分别连接在组成型启动子CaMV35S下，构建了两种植物表达载体，一种是带有DsRed报告基因，它能在转基因种子中发出红色荧光标记的表达载体P35S∶MiARF1和P35S∶MiARF2(分别命名为：pFL-MiARF1和pFL-MiARF2)；一种是含有bar报告基因标记的basta抗性的表达载体P35S∶MiARF1和P35S∶MiARF2(分别命名为：pBA-MiARF1和pBA-MiARF2);将它们分别转化感受态农杆菌EHA105，再用花浸泡法转化野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.，生态型：Columbia)。然而在荧光显微镜下，由于种子本身含有少量叶绿素，也会发出红色的荧光，因此含荧光标记的拟转基因种子不容易鉴别，难于筛选得到转基因株系。含basta抗性标记的转基因种子经过抗性筛选，得到转MiARF1和MiARF2基因拟转基因株系各9个。Sourthern杂交证明外源基因MiARF1和MiARF2已分别整合到野生型拟南芥的基因组中，分别获得了5个转基因株系。Northern杂交检测表明，转基因拟南芥中分别有4个株系可以检测到MiARF1或MiARF2基因的表达。我们以哥伦比亚野生型拟南芥为对照，对以上已经过分子鉴定的两种转基因拟南芥T3代转基因株系的根和下胚轴的表型通过用Image J.和SPSS等软件测量及统计分析发现：在23℃，1/2MS培养基上培养，光照条件下萌发七天后，转MiARF1和MiARF2基因的拟南芥株系的根长分别比野生型植株的根短22.3％和25.9％，下胚轴的长度也分别比野生型植株短16.8％和24.3％；在黑暗条件下，萌发三天后，转MiARF1和MiARF2基因植株黄化苗的根的长度分别比野生型植株短26.7％和31.6％，下胚轴的长度都也分别比的野生型植株短30.8％和32.9％(n=28，P＜0.05)。此外，我们还发现转基因植株的平均侧根数目和野生型比较没有显著差异。由此推测芒果MiARF1和MiARF2基因可能在拟南芥中作为根和下胚轴细胞生长(细胞分裂和细胞伸长)的抑制因子而影响根以及下胚轴的生长。因此，为了研究MiARF1和MiARF2基因是否可能作为转录因子对其下游基因的表达产生影响，我们用RT-PCR法，以GAPC基因的表达作为内标，对转基因植株中和细胞分裂有关的基因AUXIN-REGULATED GENE INVOLVED IN ORGAN SIZE(AGROS)、AINTEGUMENTA(ANT)和G1细胞周期蛋白基因(CYCD3；1)(Hu等，2003)的转录情况进行半定量分析，实验研究结果发现，光照条件下萌发7天的转基因株系中，ANT和AGROS基因的转录量明显下降，CYCD3；1基因的转录量不变。
为研究转基因植株的根对外源生长素敏感性的变化，我们比较了在不同浓度的外源生长素(IAA或NAA)的处理下，转基因株系幼苗(萌发9天，其中生长素处理四天)的根和野生型植株幼苗的根的长度，发现它们在相同程度上被外源生长素所抑制，例如当外源生长素IAA的浓度为10-7M时，转基因株系和野生型植株的主根根长分别和未经外源生长素处理时的转基因株系和野生型植株的主根根长相比都减短了约30％。
以上这些结果表明：MiARF1和MiARF2基因可能负调控与细胞分裂有关的基因，如ANT和AGROS基因的表达而影响拟南芥的根和下胚轴的生长；其中MiARF2基因仅含有DNA结合区(DBD区)就足以完成其转录因子的功能。外源生长素的处理并不影响MiARF1和MiARF2基因在拟南芥幼苗中的表达。
同时，为了揭示在根的生长发育方面，MiARF2基因与拟南芥ARF2基因是否存在功能上的互补，我们构建了植物表达载体P35S∶MiARF2转化拟南芥突变体arf2-8(SALK108995)，通过Northern杂交可以检测到MiARF2基因在拟南芥突变体arf2-8中的表达；然而，通过表型分析发现，光照培养下萌发5天的转基因植株的根长和突变体arf2-8的根长相比并没有变化。这说明，在根的生长发育方面，芒果MiARF2基因和拟南芥ARF2基因并不存在功能上的互补。
为了研究 MiARF2基因的表达活性，我们还构建原核表达载体pGEX-MiARF2，将MiARF2转入大肠杆菌，得到了一个约37kDa的可溶性目的蛋白，说明该基因可被诱导表达。