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昆虫是地球上数量最多的动物类群，其种类繁多、分布广泛。鳞翅目是昆虫纲的第二大目。该目的绝大多数昆虫会危害各类栽培植物，如棉铃虫（Helicoverpa armigera）和斜纹夜蛾（Spodoptera litura）等。该目也包括家蚕（Bombyx mori）这种重要的经济昆虫和模式动物。 microRNA(miRNA)是一类非编码小RNA，可以在转录后水平调控基因的表达，参与发育、凋亡、免疫、疾病等多种生物学过程。虽然目前对于鳞翅目昆虫的发育和变态机制了解尚不够深入，但已有报道证明昆虫miRNA参与变态发育的调控。因此，研究鳞翅目昆虫的miRNA可以帮助完善对其发育及变态机制的理解，在此基础上，由于变态发育是昆虫重要的发育特征，一些miRNA也可能用作鳞翅目害虫防治的靶点。 然而，在鳞翅目昆虫中，只有少数具有全基因组信息的昆虫进行了较为全面的miRNA预测鉴定研究。棉铃虫和斜纹夜蛾尚未有基于测序的miRNA预测鉴定研究。与人类miRNA的数量相比，家蚕中也应还有未鉴定出的miRNA。此外，miRNA功能研究方面，只在家蚕或个别细胞系中有初步的研究结果。在本组的研究之前，关于家蚕miRNA靶基因的预测尚未有基于表达谱的大规模分析;家蚕中miRNA的靶位点验证和体内功能研究，也尚未建立成熟的检测平台。基于这样的背景，我们对家蚕的miRNA进行了进一步的鉴定，对家蚕miRNA的靶基因进行了大规模的预测与筛选，对部分家蚕miRNA进行了功能研究，对棉铃虫和斜纹夜蛾的miRNA进行了测序鉴定。研究结果有如下四个方面: 首先，对家蚕的miRNA进行了鉴定和筛选。基于本实验室前期对家蚕miRNA的预测结果，我们使用芯片杂交的方法对未经验证的剩余部分miRNA进行了表达验证。在所有经芯片验证的家蚕miRNA中，删除了与miRBase中已知家蚕miRNA高度相似的miRNA，以及非编码RNA和mRNA降解产物等非miRNA序列，由此得到了228条miRNA。Northern杂交实验验证了其中4个miRNA的表达。通过该方法，我们除去了大量的miRNA候选序列，使鉴定到的miRNA的可信度得以提高，为后续家蚕miRNA的研究奠定了基础。 第二，我们对家蚕miRNA的靶基因进行了预测筛选。我们选择了被多个课题组共同发现的52条miRNA进行了家蚕靶基因的预测，得到了424个可能的家蚕miRNA靶基因。通过对卵、幼虫、蛹和成虫四个发育时期的RNA进行芯片杂交实验，筛选出了60个表达趋势相反的miRNA-mRNA对。经GO分析和基因注释发现，家蚕miRNA可能参与转录调节、代谢过程和信号转导通路，从而在家蚕发育的基因调控网络中发挥功能。这是家蚕中首次进行的基于不同发育时期表达趋势分析的miRNA靶基因筛选。 第三，对家蚕的miR-2家族进行了研究。我们确认了mir-2基因簇上共同转录的miRNA，同时发现了蜕皮激素对mir-2基因簇上miRNA表达的诱导调控。针对miR-2家族的各miRNA，不仅预测到了一系列凋亡或变态发育相关的靶基因，也在细胞水平筛选到了三个可能的靶基因IAP、PBAN和FTZ-F1。体内注射实验显示miR-2家族成员间可能存在相互补偿效应。这些研究结果证明了家蚕miR-2家族可能通过调节激素相关通路或凋亡过程而参与家蚕发育过程的调控，为家蚕中miR-2家族的功能研究提供了重要参考。研究过程中建立的功能研究平台为后续miRNA的研究奠定了基础。 最后，基于小RNA测序对棉铃虫和斜纹夜蛾的miRNA进行了预测鉴定。以家蚕中已发表的miRNA序列为参考，在棉铃虫和斜纹夜蛾中分别得到了97个和91个保守的miRNA。以家蚕的基因组和棉铃虫的BAC序列为参考，在棉铃虫中预测到了1个新miRNA和8个miRNA候选序列，在斜纹夜蛾中预测到了4个miRNA候选序列。其中，约60％的miRNA都是昆虫特异性的，鳞翅目特异性的占20％以上。对4个不同miRNA的表达分析显示了它们在不同发育时期的差异表达。靶位点预测在家蚕、棉铃虫和斜纹夜蛾中获得了多种功能基因的保守性miRNA靶点。其中Hsp90基因上3个保守的miRNA靶点得到了细胞实验验证。该研究为缺乏基因组信息的昆虫的miRNA预测提供了一种可选择的方法，也为鳞翅目昆虫miRNA的功能研究提供了一些基础信息。