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背景：生物体内,鞘氨醇-1-磷酸(S1P)主要是由血清中的造血细胞产生,S1P作为一种生物活性的脂类物质,也存在于脑、肝、心等组织中。当机体发生炎症时,S1P细胞释放量在炎症部位显著增加。实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化(MS)的常用动物模型。研究发现,MS病人脑脊液和EAE鼠血清中、脊髓内S1P含量均有增加,这表明S1P可能与MS/EAE的发病机理有关联。近年来的大量研究表明,S1P与其受体(SIPR)结合后,能够引起反应性星形胶质细胞化,而反应性星形胶质细胞化和神经元凋亡是MS的两大特征。维生素D作为免疫调节剂,在机体中的作用近年来特别受到关注。维生素D除可以维持血钙浓度稳定和参与免疫调节等作用外,还可以调节中枢神经细胞内蛋白的表达,从而影响MS/EAE的病程。本课题组前期工作首次证明了维生素D对MS/EAE的预防和治疗作用可能与S1P引起的免疫调控有关,由此提示,维生素D与其他抑制S1P通路的药物共同使用可能对MS/EAE起到协同治疗作用。目的：本文重点论述作用于SPHK1/S1P通路介导的维生素D在EAE发生过程中的潜在功能,为临床上探索治疗MS的方法提供实验与理论依据。方法：利用western blot实验技术分析比较SPHK表达量的变化。课题组前期工作首次发现维生素D可以降低EAE鼠体内S1P水平,而S1P水平是由其合成酶SPHK决定的。因此,我们首先采用western blot验证EAE鼠(E)和正常鼠(C)组织中SPHK合成酶表达量的变化。然后,为确定维生素D和S1P合成的关系,亦采用western blot验证EAE鼠(E)和喂食维生素D的EAE鼠(VE)组织中SPHK1合成酶表达量的变化。围绕这个主线----在组织水平发生S1P的合成关键酶SPHK1的变化,提示我们在细胞水平,与S1P有关的酶是否也在维生素D的刺激下发生含量的变化?据相关文献报道,在体内五种酶参与了S1P的合成和分解。鞘氨醇激酶1和2(SPHK1, SPHK2)能够将鞘氨醇(SPH)转变为S1P。而S1P特异性裂解酶(SGPL1)和S1P磷酸酶1和2 (SGPP1,2)(?)能够将S1P分解。为确立究竟哪种酶在本体系S1P的合成中起主导作用,我们利用Real-time PCR技术,在细胞水平上检测1,25-(OH)2D3刺激前后这五种酶基因表达量的变化,以证实维生素D对这几种酶有无直接的调控作用。同时,利用western blot检测细胞中这五种酶的蛋白表达,进而证明维生素D是影响了S1P的合成还是降解。本实验采用的PC12细胞来自大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆的细胞株。PC12细胞是一个常用的神经细胞株,广泛用于神经系统疾病的体外研究。1,25-(OH)2D3是维生素D在体内的活化形式。将1,25-(OH)2D3用培养基稀释到100nmol/1,采用梯度稀释的方法,依次得到浓度为50 nmol/1,25 nmol/1, 12.5 nmol/1,6.25 nmol/1的含1,25-(OH)2D3的培养基。将状态良好的PC12细胞接种于六孔板中,每孔细胞总数为1×105-2×105个,待细胞生长至70%-80%时进行加药刺激,分为空白对照组、100nmol/L组、50nmol/L组、25nmol/L组、12.5nmol/L组、6.25nmol/L组,每组设3个复孔,培养细胞24h、48h、72h。分别收集提取RNA、蛋白质、鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸。利用酶联免疫吸附实验(ELISA),分别测定大鼠血清、PC12细胞中鞘氨醇(SPH)及S1P含量变化。由于体内维生素D的生物学功能,往往是是通过结合维生素D受体(VDR)发挥其功能的,而结合后对于影响目标基因的转录也起到关键作用。作为实验的机制探讨部分,我们分析了VDR和SPHK1之间的相互关系。通过PC12细胞过表达和干扰VDR实验后,观察SPHK1的表达变化,并用ELISA和western blot技术来分析各组细胞中S1P和SPHK1的含量变化。结果：在EAE鼠组织中SPHK1合成酶比正常鼠组织中表达量升高,而在喂食维生素D的EAE鼠中SPHK1合成酶比EAE鼠组织中表达量降低。在组织和细胞水平上,检测1,25-(OH)2D3刺激前后这五种酶基因表达量的变化,发现合成酶变化明显,其中SPHK1变化最为显著。而裂解酶变化不明显。同时发现,在不同1,25-(OH)2D3浓度刺激下,SPHK1合成酶变化是不同的。ELISA分析大鼠血清和PC12细胞在不同浓度1,25-(OH)2D3刺激下SPH及S1P含量变化,发现高浓度的1,25-(OH)2D3刺激下的S1P含量下调明显,而SPH含量变化并不显著。通过PC12细胞过表达和干扰VDR实验,观察到SPHK1的表达有一定变化。过表达VDR后,PC12细胞在1,25-(OH)2D3刺激下SPHK1下调,而没有1,25-(OH)2D3刺激的PC12细胞SPHK1变化不明显。而干扰掉VDR后,SPHK1的变化较空白组变化不明显。结论：1.维生素D调节S1P缓解EAE的病情,可能与SPHK1的表达有关；2.在EAE中,维生素D可能通过结合其受体VDR调节SPHK1,从而影响S1P的含量；3.维生素D与治疗MS的药物联合用药可能对MS的治疗起到更好的协同治疗效果。