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研究背景截止目前,偏头痛的发病机制尚仍不是十分清楚,偏头痛发作的重要一环是三叉神经血管系统的激活。三叉神经血管系统激活这一过程接受头痛下行调节系统的调节。临床上偏头痛是一种发作性疾病,每次发作持续时间约为4-72小时,可自行缓解,我们推测头痛的下行调节系统对终止发作起一定作用。在头痛的下行调节系统中起承上启下关键作用的脑区是中脑导水管周围灰质腹外侧区(ventrolateral periaqueductal gray, vlPAG),在神经网络的高级调控中起重要作用的小清蛋白阳性(parvalbumin-expressing, PV+)中间神经元在该区域含量丰富。目的探讨vlPAG区PV+中间神经元在偏头痛发病机制中的作用方法1.运用DREADD结合Cre-loxP转基因小鼠(PV-Cre)的方法选择性静默vlPAG区的PV+中间神经元通过立体定位注射重组酶(cyclization recombination enzyme, Cre)可诱导的腺相关病毒(adreno-associated virus, AAV),将改造过的人M4毒蕈碱受体(hM4Di)特异性地表达在PV-Cre转基因小鼠(Cre基因序列靶向插入到小清蛋白的基因序列中)的vlPAG区PV+中间神经元上,然后腹腔注射hM4Di的配体即氯氮平-N-氧化物(clozapine-N-oxide, CNO)便可达到静默PV+中间神经元。该方法时空精确性非常高。2.通过电刺激上矢状窦(superior sagittal sinus, SSS)构建小鼠偏头痛动物模型48只PV-cre小鼠,随机分为6组。第1组静默PV+中间神经元后电刺激SSS并给予利扎曲坦治疗、第2组不静默PV+中间神经元情况下电刺激SSS并给予利扎曲坦治疗、第3组静默PV+中间神经元后电刺激SSS并给予生理盐水治疗、组4不静默PV+中间神经元情况下电刺激SSS并给予生理盐水治疗、第5组静默PV+中间神经元后不行SSS电刺激、第6组不静默PV+中间神经元情况下不行SSS电刺激。vlPAG区立体定向注射后4周,腺相关病毒稳定表达时,通过电刺激上矢状窦SSS构建小鼠偏头痛动物模型,连续4天腹腔注射CNO(手术当天至术后3天,1次／天)。3.行为学观察将小鼠置于观察箱中,真刺激组(第1-4组)电刺激SSS 5min,假刺激组(第5-6组)接上电极不接通电源。录制行为学录像,观察小鼠头痛相关的行为学表现过度理毛和甩头,记录过度理毛的时间、过度理毛次数和甩头次数。4.免疫染色使用双相标记,即GFP做为hM4Di表达的标记物,小清蛋白(parvalbumin, PV)的免疫活性作为PV+中间神经元的标记物进行免疫染色。Fos的免疫活性作为中脑水平神经元激活的标记物。结果1.借助Cre/loxP技术可以将hM4Di靶定于特定于vlPAG区的PV+中间神经元上。84.63%的PV+中间神经元被携带hM4Di的AAV病毒感染后产生GFP信号,84.42% GFP阳性神经元免疫荧光染色结果为PV阳性。2.刺激后第1-6组小鼠过度理毛时间分别为1.3±+1.2s,0.4+0.2 s,1.3±0.6s.6.1±2.0 s、1.3±1.1s、1.0±0.5s,电刺激SSS并给予生理盐水治疗时,静默PV+中间神经元组小鼠理毛时间显著短于不静默PV+中间神经元组小鼠(1.3+0.6 vs.6.1±2.0,P<0.01)。3.中脑的Fos表达主要集中在中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA)。第1-6组Fos细胞数分别为57.0±5.7、78.0±17.0、66.3±5.9、110.0±4.7、43.0±6.0、55.0±8.2。电刺激SSS并给予生理盐水治疗时,静默PV+中间神经元组中脑Fos阳性细胞数明显少于不静默PV+中间神经元组(66.3±5.9 vs.110.0±4.7,P<0.05)。结论1.静默vlPAG区的PV+中间神经元可以通过与VTA区的相互作用起到下行镇痛作用。2.PV+中间神经元有望成为偏头痛治疗的一个新的靶点。